半邊旗提取物5F抗結(jié)腸癌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例約800萬(wàn)人，占所有惡性腫瘤的10％～15％;在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家居惡性腫瘤發(fā)病率的前列，僅次于肺癌居腫瘤死亡原因的第二位。我國(guó)的研究顯示，結(jié)腸癌發(fā)病率近年來(lái)呈明顯上升趨勢(shì)，結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率分別為28.08/10萬(wàn)和13.41/10萬(wàn)，分別占惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第3位和第5位。雖然目前常規(guī)的治療手段在一定程度上緩解了病人的痛苦，延長(zhǎng)了病人的生存時(shí)間，但還存在不少缺陷，如對(duì)于晚期患者，手術(shù)無(wú)能

2、為力，而且創(chuàng)傷大，而化學(xué)治療則面臨越來(lái)越頻繁的耐藥難題，藥物的毒副作用也使其臨床應(yīng)用受到了限制。因此，尋找低毒高效的抗腫瘤藥物是當(dāng)今抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，研發(fā)新的抗結(jié)腸癌藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。中醫(yī)藥治療腫瘤歷史悠久，是中華民族文化遺產(chǎn)的重要組成部分。應(yīng)用中醫(yī)藥與中西醫(yī)結(jié)合治療結(jié)直腸癌等惡性腫瘤已經(jīng)越來(lái)越被廣大腫瘤專業(yè)醫(yī)生和病人所接受，是目前結(jié)腸癌綜合治療中的重要組成部分之一。現(xiàn)在臨床上主要應(yīng)用于手術(shù)后、放療化療期間的減毒增效、西醫(yī)治療間歇

3、期的鞏固治療、晚期腫瘤的扶正治療，中醫(yī)藥都有積累了很多寶貴的經(jīng)驗(yàn)。臨床實(shí)踐證實(shí)，中醫(yī)藥和中西醫(yī)結(jié)合治療惡性腫瘤有以下優(yōu)勢(shì):①有效改善臨床癥狀和生存質(zhì)量，提高5年生存率;②加快術(shù)后的恢復(fù)如促進(jìn)肛門排氣，降低術(shù)后并發(fā)癥如腹部手術(shù)后腸粘連;③對(duì)放療和化療期間合用有減毒增效作用;④提高人體免疫力，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。中藥是新藥研發(fā)中的重要領(lǐng)域，許多中藥由于其低毒性及其巨大藥用價(jià)值，更是被廣泛用于藥物篩選。中藥作為抗癌藥物已愈來(lái)愈受到重視，許多中藥

4、活性成分及其分子靶點(diǎn)也已被鑒定。由于作用機(jī)制獨(dú)特，一些中藥活性成分對(duì)某些癌癥不僅表現(xiàn)出高度特異性及良好抗癌效果，而且毒副作用輕微，因此已成功進(jìn)入臨床并且在腫瘤治療實(shí)踐中發(fā)揮了重要甚至關(guān)鍵作用，如紫杉醇及其衍生物的發(fā)現(xiàn)就是極佳證明。根據(jù)現(xiàn)代科技手段開(kāi)發(fā)了很多中藥抗癌新藥已經(jīng)在臨床上廣泛使用，如惹苗仁提取物康萊特注射液，復(fù)方斑鰲提取物艾迪注射液，香菇多糖注射液，黃茂多糖注射液等，以及提高免疫力的中成藥:補(bǔ)中益氣顆粒，河車大造膠囊，養(yǎng)血飲等都

5、與放化療合用。有關(guān)中西醫(yī)結(jié)合治療結(jié)直腸癌等腫瘤的臨床報(bào)道很多，清熱解毒，扶正固本、活血化淤等是常用療法，雖然單獨(dú)使用中藥抑瘤效果不及放化療，但是不良反應(yīng)較少，它所具有的扶正作用和個(gè)體化治療是放化療所不能及的。
　　 半邊旗（Pteris Semipinnata L），別名半邊蕨、單片鋸、半邊牙、半邊梳、半邊風(fēng)藥，系鳳尾蕨科植物，為南方民間常用中草藥，始載于《嶺南采藥錄》，性味苦、辛，涼，歸肝經(jīng)、大腸經(jīng)，具有清熱解毒，消腫止痛的功

6、效，常用于治療腸炎、菌痢、肝炎和結(jié)膜炎等。課題組經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)半邊旗的水提物和醇提物均能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)小鼠移植瘤有明顯抑制作用。通過(guò)對(duì)半邊旗粗提取物的分離純化得到具有強(qiáng)抗腫瘤活性的貝殼杉烷型二萜類化合物5F（ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-olic acid）]。目前已發(fā)現(xiàn)半邊旗提取物5F對(duì)白血病、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌和胰腺癌等多種癌細(xì)胞有明顯抑制作用，對(duì)小鼠S180肉瘤、

7、淋巴肉瘤及HepA肝癌均有明顯抑制作用，能降低NNK誘導(dǎo)的肺癌和DEN誘導(dǎo)的肝癌的數(shù)量和大小。其抗腫瘤機(jī)制可能與誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯有關(guān);可抑制NF-κB信號(hào)通路，從而抑制癌基因Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，下調(diào)增殖相關(guān)蛋白(Cyclin D1、COX-2和EGFR)和凋亡相關(guān)蛋白(Survivin)的表達(dá)，促進(jìn)凋亡抑制蛋白Bax表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡;通過(guò)p53介導(dǎo)的線粒體途徑，促進(jìn)B

8、ax基因表達(dá)，使線粒體釋放細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)到胞漿，引起細(xì)胞凋亡;影響MAPK通路的ERK1/2、JNK和p38基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期;對(duì)高轉(zhuǎn)移卵巢癌、高轉(zhuǎn)移肺癌等癌細(xì)胞有降低其侵襲和轉(zhuǎn)移能力的作用，這與下調(diào)VEGF、MMP-9和uPA表達(dá)，上調(diào)PTEN的表達(dá)有關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了5F在抗腫瘤應(yīng)用中的廣泛前景，為5F的開(kāi)發(fā)利用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。盡管5F在藥效學(xué)及其作用機(jī)制的研究中做了大量的工作，但其

9、確切作用機(jī)制仍未明確。因此我們希望進(jìn)一步深入研究半邊旗提取物5F在體內(nèi)外對(duì)結(jié)腸癌的作用并探討其作用機(jī)制，為5F作為結(jié)腸癌的預(yù)防或治療用藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為四個(gè)部分：
　　 第一章：5F對(duì)C26結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。
　　 目的：觀察5F對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株C26細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況。
　　 方法：采用臺(tái)盼藍(lán)染料排斥實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度的5F干預(yù)24、48和72h后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;四唑鹽(MTT)分析法來(lái)檢測(cè)其對(duì)細(xì)

10、胞活力的影響;[3H]-胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)細(xì)胞DNA合成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間差異，方差齊時(shí)采用Tukey HSD進(jìn)行多重比較，方差不齊采用Tamhane's T2進(jìn)行多重比較，多因素采用析因分析比較各處理方式的主效應(yīng)及交互效應(yīng)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴在臺(tái)盼藍(lán)染料排斥實(shí)驗(yàn)中，5F能夠顯著抑制C26細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系。5、10、20、4

11、0和80μg/ml5F作用24h，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為4.75±3.38％、15.13±8.26％、40.72±3.39％、68.52±4.27％和87.16±6.73％，10、20、40和80μg/ml劑量組與對(duì)照組相比差異具有顯著性;作用48h，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為28.48±8.22％、52.78±4.36％、66.37±3.56％、81.16±6.22％和95.62±3.62％，差異具有顯著性;作用72h，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為4

12、0.71±4.37％、62.79±3.23％、81.78±5.57％、96.19±2.29％和98.95±0.61％，差異具有顯著性。⑵MTT分析實(shí)驗(yàn)顯示，5F能夠顯著抑制細(xì)胞活力水平，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系。5、10、20、40和80μg/ml5F作用24h，細(xì)胞活力抑制率分別為2.75±2.38％、8.57±5.68％、37.12±6.38％、75.65±5.97％和87.64±3.75％，10、20、40和80μg/ml

13、劑量組與對(duì)照組相比差異具有顯著性;作用48h，細(xì)胞活力抑制率分別為25.59±7.61％、55.91±5.75％、76.14±4.38％、89.06±3.22％和97.22±0.24％，10、20、40和80μg/ml劑量組與對(duì)照組相比差異具有顯著性;作用72h，細(xì)胞活力抑制率分別為35.89±3.67％、68.29±1.11％、79.18±2.98％、90.89±3.29％和97.95±0.12％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑶[3H]-胸腺

14、嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)表明，5F可以顯著抑制C26細(xì)胞DNA合成，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系和劑量依賴關(guān)系。5、10、20、40和80μg/ml5F孵育24h，C26細(xì)胞的DNA合成率分別為DMSO對(duì)照組的96.01±6.35％、89.34±5.29％、70.12±5.53％、41.57±1.92％和29.23±6.73％，10、20、40和80μg/ml劑量組與對(duì)照組相比差異具有顯著性;孵育48h，細(xì)胞DNA合成率分別為DMSO對(duì)照組的85.79±3.

15、96％、61.08±8.13％、32.22±4.72％、18.83±2.08％和10.78±1.29％，差異具有顯著性;孵育72h，細(xì)胞DNA合成率分別為對(duì)照組的72.37±2.62％、51.98±6.21％、26.53±1.99％、10.41±4.23％和6.54±2.04％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：5F能夠顯著抑制C26細(xì)胞的增殖、細(xì)胞活力以及DNA合成，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系。
　　 第二章：5F

16、對(duì)C26結(jié)腸癌細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)控蛋白的影響。
　　 目的：觀察5F對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株C26細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，并檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白的變化，初步探討5F抑制C26細(xì)胞生長(zhǎng)的可能機(jī)制。
　　 方法：對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PI染色，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量，進(jìn)而評(píng)價(jià)5F對(duì)C26細(xì)胞周期分布的影響。使用annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞儀定量分析磷脂酰絲氨酸外翻程度從而檢

17、測(cè)5F作用后細(xì)胞凋亡比例的變化。進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，分析細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。使用caspase-3、caspase-8和caspase-9分光光度法檢測(cè)試劑盒，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。對(duì)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白CDK1、Cyclin B1、p21、p53、Bax、Bcl-2和caspase-3、8、9結(jié)果的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果

18、采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間差異，若方差不齊，采用校正的F檢驗(yàn)Welch法代替。多重比較方差齊時(shí)采用Tukey HSD，方差不齊采用Tamhane' sT2。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴5F能夠誘導(dǎo)C26細(xì)胞發(fā)生G2/M周期阻滯，而且這一效應(yīng)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。10μg/ml和20μg/ml5F孵育24h，G2/M期比例由9.60±1.32％分別升高到15.49±1.70％和35.20±4

19、.80％;孵育48h，G2/M期比例由6.59±1.27％分別升高到19.37±5.80％和41.75±3.94％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20μg/ml5F孵育6h、12h、24h和48h后，G2/M期比例由8.81±1.99％分別上升到16.47±1.33％、21.61±2.07％、33.14±3.26％和40.06±3.82％，差異具有顯著性。⑵C26細(xì)胞經(jīng)annexin V-FITC/PI雙染后，流式細(xì)胞儀分析顯示，C26細(xì)胞分別與5

20、μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml5F孵育24h后，晚期凋亡細(xì)胞所占比例分別為1.98±0.46％、4.33±0.58％、7.93±0.31％和8.07±0.80％，早期凋亡細(xì)胞所占比例分別為4.33±0.78％、5.05±0.52％、8.53±0.46％和17.08±0.75％，發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例分別從5.15±0.46％升高到6.32±0.58％、9.38±0.90％、16.47±0.59％和2

21、5.15±1.20％，差異具有顯著性。⑶20μg/ml5F孵育24h，CDK1、Cyclin B1的表達(dá)降低，CDK1的表達(dá)水平為對(duì)照組的73.10±6.95％，Cyclin B1的表達(dá)水平為對(duì)照組的62.45±5.73％;p21、p53的表達(dá)增加，p21的表達(dá)水平為對(duì)照組的254.17±26.95％，p53的表達(dá)水平為對(duì)照組的704.90±15.73％; Bax蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的414.94±18.95％，Bcl-2蛋白表達(dá)量為對(duì)

22、照組的46.90±5.73％，Bax/Bcl-2比例由0.95升高到8.45; caspase-3活性由0.211±0.067增加到0.398±0.095，caspase-9活性由0.201±0.039增加到0.518±0.084，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。caspase-8的活性沒(méi)有明顯變化。
　　 結(jié)論：①5F能夠誘導(dǎo)C26細(xì)胞發(fā)生G2/M周期阻滯，而且這一效應(yīng)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。②5F能夠誘導(dǎo)C26細(xì)胞凋亡，而且這一效應(yīng)

23、具有劑量依賴性。③5F使細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控蛋白CyclinB1和CDK1蛋白表達(dá)降低，抗凋亡的Bcl-2蛋白表達(dá)量下調(diào)而促進(jìn)凋亡Bax蛋白表達(dá)量上升，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比例升高，p21和p53的表達(dá)增加，caspase-3和caspase-9活性增加而caspase-8的活性沒(méi)有明顯變化。
　　 第三章：5F抗癌作用與cAMP信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系研究。
　　 目的：觀察5F對(duì)C26結(jié)腸癌細(xì)胞環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平的影

24、響，探討該變化與5F抗腫瘤作用之間的關(guān)系。
　　 方法：以不同時(shí)間、不同濃度5F處理C26細(xì)胞，放免法測(cè)定cAMP含量。磷酸二酯酶抑制劑3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)預(yù)先孵育后再與5F聯(lián)合應(yīng)用，放免法檢測(cè)cAMP含量，MTT法檢測(cè)C26細(xì)胞活力。統(tǒng)計(jì)方法主要為單因素方差分析(ANOVA)，多重比較方差齊時(shí)采用Tukey HSD，方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2，多因素采用析因分析比較各處

25、理方式的主效應(yīng)及交互效應(yīng)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴20μg/ml5F分別作用于C26細(xì)胞5、10、20和30min，cAMP含量分別為1.43±0.11 pmol/mg、1.77±0.16pmol/mg、2.13±0.12 pmol/mg和2.10±0.16pmol/mg，隨著作用時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，cAMP含量逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵5、10、20、40μg/ml5F作用于C26細(xì)胞20min，cAM

26、P含量分別為對(duì)照組的116.08±7.27％、143.60±5.56％、166.76±9.28％和201.09±13.51％，隨著5F劑量增加，cAMP含量逐漸提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑶最大劑量的廣譜磷酸二酯酶抑制劑IBMX0.5 mM預(yù)先孵育15min，然后再加入不同濃度5F孵育15min，結(jié)果顯示，0.5 mM IBMX組cAMP含量為對(duì)照組的251.72±12.70％(P＜0.01);5μg/ml和10μg/ml5F組cAMP含

27、量為對(duì)照組的124.71±8.01％和163.51±8.02％(P＜0.01);而IBMX分別與5μg/ml、10μg/ml5F聯(lián)合應(yīng)用，cAMP含量分別為對(duì)照組的294.83±9.08％和341.38±14.24％(P＜0.01)，IBMX與5F兩者之間沒(méi)有交互效應(yīng)。⑷0.5 mM IBMX預(yù)先孵育15min，然后再加入不同濃度5F孵育48h，結(jié)果顯不，0.5 mM IBMX組細(xì)胞存活率為74.57±3.53％(P＜0.01)。與單獨(dú)

28、使用5F相比，5μg/ml5F和IBMX聯(lián)合應(yīng)用可以使C26細(xì)胞存活率由70.47±6.89％降低到55.28±1.45％(P＜0.01)，10μg/ml5F和IBMX聯(lián)合應(yīng)用可以使C26細(xì)胞存活率由43.83±2.66％降低到26.88±4.32％(P＜0.01)，IBMX與5F兩者之間沒(méi)有交互效應(yīng)。
　　 結(jié)論：①5F可以增加C26細(xì)胞cAMP含量，而且這一效應(yīng)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。②5F可能通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶(AC

29、)增加C26細(xì)胞cAMP含量。③在抑制C26細(xì)胞增殖方面，5F與IBMX沒(méi)有交互效應(yīng)。
　　 第四章：5F對(duì)結(jié)腸癌動(dòng)物模型腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 目的：觀察5F對(duì)C26結(jié)腸癌荷瘤小鼠和DMH/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響，以及5F對(duì)肝腎功能的影響，研究5F的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)及毒副作用。
　　 方法：通過(guò)腋下接種C26細(xì)胞建立結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型，觀察5F作用后小鼠體重和腫瘤重量的變化。聯(lián)合應(yīng)用致癌

30、劑DMH和致炎劑DSS建立結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌模型，觀察小鼠體重、腫瘤數(shù)量和大小的變化，檢測(cè)血AST、ALT、BUN和Cr的含量。對(duì)DMH/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌模型中平均腫瘤數(shù)量和腫瘤大小的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間差異，方差齊時(shí)采用Tukey HSD進(jìn)行多重比較，方差不齊采用Tamhane' sT2進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴C26結(jié)腸癌荷瘤

31、動(dòng)物模型:5F50mg/kg和100mg/kg劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療后的體重略高于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在腫瘤重量方面，模型組平均瘤重為1.29±0.22g，5F50 mg/kg和100 mg/kg劑量組平均瘤重分別為0.76±0.19g和0.45±0.12，明顯低于模型組，差異具有顯著性。腫瘤抑制率分別為41.38％和64.87％。⑵DMH/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌模型:模型組小鼠共發(fā)現(xiàn)腫瘤49個(gè)，平均每只小鼠有腫瘤5.44±

32、1.33個(gè)，腫瘤平均大小為3.22±1.1mm;5F組共發(fā)現(xiàn)腫瘤35個(gè)，平均每只小鼠有腫瘤3.5±1.08個(gè)，腫瘤平均大小為2.51±0.85mm，5F組腫瘤的數(shù)量和大小均低于模型組(P＜0.01)。⑶模型組和5F組小鼠AST分別為正常對(duì)照組的117.28±17.17％和109.8±18.75％，較正常對(duì)照組有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ALT分別為正常對(duì)照組的135.11±24.88％和126.85±22.08％，明顯高于正常對(duì)照組，