重組多肽CS5931的制備工藝優(yōu)化及體內(nèi)外抗結(jié)腸癌作用.pdf

1、目的：
　　對(duì)重組多肽CS5931的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究其體內(nèi)外抗結(jié)腸癌的作用，為將來(lái)的中試放大和藥理學(xué)研究提供依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.以 pET28a為載體質(zhì)粒，以大腸桿菌 BL21(DE3)為表達(dá)菌株，構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-CS5931和pET28a-DDDK-CS5931并分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株中，進(jìn)行重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達(dá)；將發(fā)酵所得菌體裂解后進(jìn)行超聲破碎離心處理，利用鎳柱

2、親和層析法、使用儀器AKTA-Purifier100進(jìn)行多肽的分離純化；利用SDS-PAGE和Western blot法檢測(cè)重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達(dá)。
　　2.以大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-CS5931為發(fā)酵菌株，從碳源、氮源、磷酸鹽、Mg2+、誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）的濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等方面優(yōu)化表達(dá)體系的發(fā)酵制備工藝。利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選

3、出對(duì)重組多肽CS5931的表達(dá)影響最大的3個(gè)因素，并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，通過(guò)中心組和實(shí)驗(yàn)（CCD）結(jié)果篩選出3個(gè)因素的最佳組合。
　　3.利用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化復(fù)性液成分，包括小分子物質(zhì)甘油、尿素和谷胱甘肽，并檢測(cè)了利用優(yōu)化后的復(fù)性液進(jìn)行復(fù)性所制備重組多肽 CS5931的表達(dá)量及抗結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的活性。
　　4.利用MTT法評(píng)價(jià)重組薩氏海鞘多肽 CS5931和CS5931-EK對(duì)體外結(jié)腸癌細(xì)胞HCT11

4、6的增殖抑制作用。建立人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116裸鼠移植瘤模型，并利用該模型考察重組薩氏海鞘多肽CS5931的體內(nèi)抗結(jié)腸癌作用。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了pET28a/CS5931質(zhì)粒和pET28a-DDDK-CS5931質(zhì)粒并表達(dá)了重組多肽CS5931和CS5931-EK。重組多肽CS5931經(jīng)分離純化后呈單一條帶，且純度可達(dá)到98％。重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達(dá)量分別為每升發(fā)酵液2.0 mg和1.5

5、 mg。
　　2.發(fā)酵制備工藝優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為酵母提取物濃度30 g/L，甘油濃度0.45%，IPTG濃度0.75 mM，誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)時(shí)間20 h。優(yōu)化后重組多肽CS5931的表達(dá)量從2.0 mg/L提高到7.5 mg/L，與優(yōu)化前相比提高了2.75倍。
　　3.優(yōu)化后的復(fù)性液能夠顯著提高重組多肽CS5931的抗結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的活性，對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的半數(shù)抑制濃度IC50值從23.2μM下

6、降到11.6μM（活性增強(qiáng)1倍）。優(yōu)化后復(fù)性液組分確定為50 mM Tris，0.5 mM EDTA，50 mM NaCl，0.5 mM L-精氨酸，5%甘油，2 M尿素和2 mM/0.2 mM GSH/GSSH。
　　4.所制備的重組多肽CS5931和CS5931-EK都具有顯著的體外抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的活性，His-tag的有無(wú)對(duì)重組多肽的抗結(jié)腸癌作用沒(méi)有明顯影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明重組多肽CS5931在25 mg/kg劑量時(shí)顯著抑制

7、人結(jié)腸癌HCT116裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，且抗癌效果呈劑量依賴(lài)性，在同劑量（50 mg/kg）下抗癌效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺（CTX），同時(shí)用藥期間未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡，顯示該重組多肽具有一定的安全性。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和中心組和實(shí)驗(yàn)對(duì)重組多肽 CS5931的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。使用優(yōu)化后的工藝制備重組多肽CS5931，表達(dá)量從2.0 mg/L提高到7.5 mg/L，與優(yōu)化前相比