雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)人結(jié)腸癌SW480的體內(nèi)外抗癌作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)人結(jié)腸癌SW480的體內(nèi)外抗癌作用及相關(guān)機(jī)制的研究雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TPL)又稱雷公藤甲素，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬中分離到的主要有效成分，系二萜內(nèi)酯化合物，藥理活性強(qiáng)，具有抗炎、抗生育和免疫調(diào)節(jié)等作用，能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，具有廣泛的抗瘤譜，還能增加腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，是比較有前途的抗腫瘤藥物。但其毒性較大，安全范圍較窄，妨礙了其在臨床上的進(jìn)一步推廣。本單位的前期研究發(fā)現(xiàn)TPL對(duì)人結(jié)腸癌等消化道腫瘤的

2、裸鼠移植模型具有較強(qiáng)的抗癌作用，強(qiáng)于臨床上消化道腫瘤常用的化療藥物。由于在臨床上對(duì)消化道常見實(shí)體瘤的化療通常由一個(gè)以上的化療藥組成合理的化療方案進(jìn)行治療。因此，在深入探討TPL的作用特點(diǎn)與作用機(jī)制的基礎(chǔ)上尋找與TPL具有協(xié)同作用的抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用于消化道腫瘤的治療，既降低TPL使用劑量又發(fā)揮其抗癌效應(yīng)，就成為現(xiàn)在急需解決的主要問題。盡管文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤內(nèi)酯醇抗腫瘤作用可能通過多種機(jī)制，但其確切的抗癌機(jī)制仍未十分明確。因此，我們認(rèn)為有必要

3、對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇及其與其它抗癌藥聯(lián)合作用抗腫瘤的機(jī)制進(jìn)行深入探討。 一、雷公藤內(nèi)酯醇體外抗結(jié)腸癌細(xì)胞SW480作用及相關(guān)機(jī)制的研究 為了探討TPL抑制SW480細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用特點(diǎn)與作用機(jī)制，分別研究了TPL，對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶、微管蛋白、HSP70及與其相關(guān)的細(xì)胞增殖和凋亡信號(hào)分子的影響。 研究方法： (1)用MTT法觀察雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響； (2)用集落形成法觀察TPL對(duì)細(xì)胞集落形成

4、的影響； (3)用AO/EB熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率； (4)從SW480細(xì)胞中提取含有的TOPO Ⅰ、TOPO Ⅱ粗酶溶液用于實(shí)驗(yàn)，通過TOPO Ⅰ、TOP0 Ⅱ介導(dǎo)的負(fù)超螺旋pBR322質(zhì)粒解旋反應(yīng)檢測(cè)TPL對(duì)TOPO Ⅰ、TOPO Ⅱ酶活性的影響： (5)用濁度法檢測(cè)，TPL對(duì)提取的豬腦微管蛋白體外聚合反應(yīng)的影響； (6)分光光度法檢測(cè)TPL對(duì)細(xì)胞caspase-3和caspase-9活性的影響；

5、 (7)用RT-PCR半定量法檢測(cè)TPL對(duì)SW480細(xì)胞HSP70 mRNA的影響； (8)用Western blot方法觀察TPL對(duì)熱休克蛋白70(HSP70)及與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)信號(hào)分子的影響； (9)用AO-relocation法、AO-uptake法觀察TPL對(duì)溶酶體結(jié)構(gòu)的影響； (10)SB203580預(yù)處理對(duì)TPL誘導(dǎo)SW480細(xì)胞增殖抑制和凋亡的影響。 結(jié)果顯示： (1)TP

6、L抑制SW480細(xì)胞增殖，呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，TPL作用48小時(shí)，IC50約為14.14ng/ml； (2)TPL影響SW480細(xì)胞的集落形成，呈量效關(guān)系； (3)TPL誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴關(guān)系； (4)TPL在有效濃度對(duì)SW480細(xì)胞TOPO Ⅰ的酶活性無明顯影響；當(dāng)TPL濃度高達(dá)到400μg/ml時(shí)，才能夠抑制SW480細(xì)胞TOPO Ⅱ的酶活性； (5)TPL 0.1-10μg/ml不

7、抑制體外微管蛋白的聚合，相反有一定促進(jìn)微管蛋白聚合的趨勢(shì)，但是差異不顯著； (6)TPL在有效濃度能增加細(xì)胞caspase-3和caspase-9的活性； (7)TPL在有效濃度能下調(diào)HSP70 mRNA和蛋白表達(dá)，且呈量效及時(shí)效關(guān)系； (8)TPL在有效濃度能下調(diào)p53、c-myc、Bcl-2和P-Erk1/2蛋白含量；上調(diào)Bax蛋白和p-p38蛋白含量；不影響Erk1/2蛋白的表達(dá)； (9)SW480

8、細(xì)胞經(jīng)TPL處理后溶酶體結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞； (10)p38特異性抑制劑SB203580部分阻斷TPL對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制和凋亡作用。 二、雷公藤內(nèi)酯醇與奧沙利鉑合用對(duì)SW480細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制的研究 結(jié)腸癌治療產(chǎn)生耐藥的原因之一，是化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞大量表達(dá)HSP70，TPL在體外對(duì)SW480細(xì)胞產(chǎn)生抗癌作用的同時(shí)可下調(diào)HSP70，這一特點(diǎn)提示，TPL與結(jié)腸癌治療的常用藥奧沙利鉑(Oxalipl

9、atin，OXA)聯(lián)合應(yīng)用可能具有協(xié)同效應(yīng)。本研究觀察TPL與OXA聯(lián)合對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響；觀察TPL與OXA合用對(duì)HSP70以及與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的信號(hào)分子的影響。 研究方法： (1)用MTT法觀察TPL與OXA聯(lián)合對(duì)細(xì)胞增殖的影響； (2)用集落形成法觀察TPL與OXA聯(lián)合對(duì)細(xì)胞集落形成的影響； (3)用流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry,FCM)檢測(cè)TPL與OXA聯(lián)合對(duì)細(xì)

10、胞凋亡的影響； (4)分光光度法檢測(cè)TPL與OXA聯(lián)合對(duì)細(xì)胞caspase-3和caspase-9活性的影響； (5)用Western blot方法觀察TPL與OXA聯(lián)合對(duì)熱休克蛋白70(HSP70)及與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)信號(hào)分子的影響； (6)SB203580預(yù)處理對(duì)TPL與OXA聯(lián)合誘導(dǎo)SW480細(xì)胞增殖抑制和凋亡的影響。 結(jié)果顯示： (1)TPL與OXA協(xié)同抗SW480細(xì)胞增殖，作用48h的

11、協(xié)同指數(shù)CI<1.1； (2)TPL協(xié)同OXA抗SW480細(xì)胞集落的形成(CI<0.9)； (3)TPL與OXA協(xié)同誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的凋亡； (4)TPL與OXA協(xié)同增加細(xì)胞caspase-3和caspase-9的活性； (5)OXA能上調(diào)SW480細(xì)胞的HSP70的水平，TPL與OXA聯(lián)用后可下調(diào)OXA增高的HSP70水平，還可減少細(xì)胞原有的HSP70水平； (6)TPL協(xié)同OXA下調(diào)p53蛋

12、白的表達(dá)，還可協(xié)同上調(diào)Bax、p-p38蛋白的表達(dá)； (7)TPL與OXA聯(lián)合對(duì)P-Erk1/2、Erk1/2蛋白無明顯影響； (8)SB203580部分阻斷TPL與OXA聯(lián)合對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制和凋亡作用。 三、雷公藤內(nèi)酯醇與奧沙利鉑合用對(duì)SW480細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的作用及相關(guān)機(jī)制的研究 雷公藤內(nèi)酯醇與奧沙利鉑合用在體外可以協(xié)同抑制SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，那么二者對(duì)SW480細(xì)胞裸鼠

13、移植瘤的增殖是否也有協(xié)同抑制作用，其中可能的機(jī)制又有哪些? 研究方法： (1)建立SW480細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型； (2)實(shí)驗(yàn)設(shè)2％丙二醇生理鹽水陰性對(duì)照組、雷公藤內(nèi)酯醇組(0.1mg/kg)、奧沙利鉑組(5mg/kg)、雷公藤內(nèi)酯醇和奧沙利鉑聯(lián)合組(TPL 0.1mg/kg+OXA 5mg/kg)，每組6只裸鼠。雷公藤內(nèi)酯醇采用尾靜脈給藥，每2天給藥一次，共7次；奧沙利鉑采用腹腔給藥，每3天給藥一次，共5次。

14、未次給藥后24小時(shí)，處死裸鼠。稱量離體瘤塊重量、計(jì)算抑瘤率： (3)摘除眼球取血檢測(cè)血常規(guī)及肝腎功能； (4)HE染色光鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)； (5)免疫組織化學(xué)檢測(cè)TPL與OXA對(duì)腫瘤組織HSP70蛋白表達(dá)的影響； (6)免疫印跡檢測(cè)TPL與OXA對(duì)腫瘤組織中HSP70、p53、Bax的蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)論： 1.TPL能抑制SW480細(xì)胞增殖，呈量效、時(shí)效關(guān)系，作用48hIC5

15、0約為14.14ng/ml；TPL 8～100ng/ml作用48h誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，呈量效關(guān)系； 2.TPL的濃度高達(dá)到400μg/ml時(shí)，能夠抑制SW480細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性，但對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性無明顯影響； 3.TPL 0.1～10 μg/ml不抑制體外微管蛋白的聚合，相反有一定促進(jìn)微管蛋白聚合的趨勢(shì)，但是差異不顯著； 4.TPL抑制SW480細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能與其下調(diào)HSP70的表

16、達(dá)，并下調(diào)突變型p53、Bcl-2蛋白的表達(dá)和增強(qiáng)caspase-3、caspase-9、的Bax活性，以及對(duì)溶酶體結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)；還可能與TPL促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)、激活p-p38 MAPK、抑制p-Erk1/2和c-myc有關(guān)： 5.p38抑制劑SB203580能部分逆轉(zhuǎn)TPL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明p38 MAPK的激活在TPL誘導(dǎo)凋亡中起重要作用； 6.TPL協(xié)同OXA抑制SW480細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能與T

17、PL能對(duì)抗OXA誘發(fā)的HSP70蛋白高表達(dá)，并下調(diào)突變型p53蛋白的表達(dá)和增強(qiáng)caspase-3、caspase-9、Bax的活性有關(guān)；還可能與TPL能協(xié)同OXA促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)、激活p38MAPK有關(guān)；p38抑制劑SB203580能部分逆轉(zhuǎn)TPL與OXA聯(lián)合誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明p38 MAPK的激活在TPL與OXA聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡中起重要作用； 7.低劑量TPL能抑制SW480裸鼠異種移植瘤的生長(zhǎng)；低劑量TPL與OXA聯(lián)合對(duì)SW