香加皮杠柳苷對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的體內(nèi)外增殖及Wnt-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的：觀察香加皮杠柳苷（periplocin extracted from cortex periplocae，CPP）對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480在體內(nèi)外增殖的抑制作用，研究其對(duì)SW480細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用和對(duì)β-catenin/TCF下游靶基因的影響，以探討CPP的抗腫瘤作用機(jī)制，為CPP作為抗腫瘤藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.采用四甲基偶氮唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)不同

2、濃度CPP（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μg/ml），處理不同時(shí)間（24、48和72小時(shí)）對(duì)SW480細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用。
　　 2.采用光鏡及透射電鏡（TEM）觀察CPP作用后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.采用流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)CPP（0.5μg/ml）作用不同時(shí)間（0、6、12和24小時(shí)），SW480細(xì)胞凋亡變化和細(xì)胞周期分布情況。
　　 4.免疫熒光

3、和激光共聚焦顯微鏡（laser scanning microscope，LSM）觀察CPP（0.5μg/ml）作用12h后，SW480細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的亞細(xì)胞定位改變。
　　 5.采用免疫印跡（western blot）方法檢測(cè)不同濃度CPP（0、0.125、0.5、2.0μg/ml）作用24小時(shí)后，SW480細(xì)胞總蛋白、細(xì)胞漿蛋白及細(xì)胞核蛋白β-catenin表達(dá)變化。
　　 6.采用電泳遷移率改變（EMS

4、A）方法分析不同濃度CPP（0、0.125、0.5、2.0μg/ml）作用24小時(shí)后，SW480細(xì)胞TCF復(fù)合物與其特異性DNA結(jié)合序列結(jié)合能力變化。
　　 7.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（revers transcription PCR，RT-PCR）半定量檢測(cè)不同濃度CPP（0、0.125、0.5、2.0μg/ml）作用24小時(shí)后，SW480細(xì)胞β-catenin、survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表達(dá)

5、變化。
　　 8.建立人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480裸鼠移植瘤模型，12只實(shí)驗(yàn)裸鼠隨機(jī)分為CPP處理組和對(duì)照組。CPP處理組小鼠于瘤旁注射CPP（30 mg/kg），每日1次，對(duì)照組小鼠于瘤旁注射生理鹽水（NS），每隔3天測(cè)定腫瘤大小1次，用藥12天后引頸處死裸鼠，完整剝離瘤體，分別稱瘤重、測(cè)體積，計(jì)算抑瘤率。
　　 9.HE染色光鏡下觀察移植瘤組織學(xué)形態(tài)變化。
　　 10.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)兩組腫瘤組織中β-cate

6、nin、survivin及c-myc蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.CPP在0.125～2.0μg/ml濃度范圍內(nèi)能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480體外增殖反應(yīng)（P＜0.01），抑制率呈明顯的濃度和時(shí)間依賴性，其中2.0μg/ml CPP作用72h的抑制率最高，達(dá)到91.71％。
　　 2.CPP作用后，SW480細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，CPP可

7、誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯（由17.54％上升至37.87％），并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞凋亡，以0.5μg/ml CPP作用24h時(shí)的凋亡率為最高，達(dá)到36.52％。
　　 4.免疫熒光染色結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞β-catenin蛋白以胞核和胞漿分布為主，綠色熒光密集點(diǎn)狀分布于胞核與胞漿內(nèi)；CPP作用后，β-catenin蛋白在胞漿的相對(duì)表達(dá)量明顯多于胞核。
　　 5.Western blot分析結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃

8、度CPP處理24小時(shí)后，SW480細(xì)胞總蛋白、胞漿蛋白和胞核蛋白中的β-catenin分子表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。
　　 6.EMSA分析結(jié)果顯示，不同濃度CPP作用24小時(shí)后，SW480細(xì)胞TCF復(fù)合物與其特異性DNA結(jié)合序列結(jié)合活性下降。
　　 7.半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度CPP處理24h后，SW480細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)水平無明顯變化，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

9、＞0.05），而β-catenin/TCF下游靶基因survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表達(dá)水平隨作用濃度的增加而降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 8.成功地建立了人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，成瘤率為100％。CPP處理組平均瘤體積為0.515±0.184 cm3，平均瘤重為1.367±0.398 g，抑瘤率為61.41％，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

10、
　　 9.經(jīng)HE染色光鏡下觀察結(jié)果顯示，CPP處理組荷瘤小鼠腫瘤組織中可見較多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及均勻紅染無結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)。
　　 10.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組移植瘤組織均有β-catenin、survivin和c-myc蛋白表達(dá)，并且與對(duì)照組相比，CPP處理組的各蛋白表達(dá)均有不同程度減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.CPP在一定濃度范圍內(nèi)，能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW48

11、0的體外增殖，具有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系；其對(duì)SW480細(xì)胞的抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。
　　 2.CPP可抑制SW480細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其機(jī)制可能是改變?chǔ)?catenin分子的亞細(xì)胞定位、降低了細(xì)胞總蛋白、胞漿蛋白和胞核蛋白中的β-catenin分子表達(dá)，抑制TCF復(fù)合物與其特異性DNA結(jié)合序列結(jié)合活性，使β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性降低。
　　 3.CPP抑制SW

12、480細(xì)胞β-catenin/TCF下游靶基因survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表達(dá)，而β-catenin mRNA表達(dá)水平未見明顯改變，說明CPP對(duì)細(xì)胞β-catenin的調(diào)節(jié)不在mRNA水平，而很可能在蛋白降解水平；其下游靶基因survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表達(dá)降低，與CPP誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡并發(fā)生G0/G1期阻滯相一致。
　　 4.CPP能夠抑制SW480細(xì)胞的裸鼠移植瘤