基于MMP-3和MMP-8的高通量藥物篩選體系的建立.pdf

1、細胞外基質(zhì)是由細胞分泌到細胞外間質(zhì)中的多糖、蛋白質(zhì)和蛋白聚糖等大分子物質(zhì)構成的復雜網(wǎng)架結構，其不僅能夠維持正常組織的結構與功能，還在細胞增殖、生長和分化過程中起著非常重要的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類依賴Zn2+的肽鏈內(nèi)切酶，是參與細胞外基質(zhì)降解和重構的關鍵酶之一，這一過程對于細胞的增殖與分化、細胞凋亡、血管生成和胚胎發(fā)育非常關鍵。基質(zhì)金屬蛋白酶不但能切割細胞外基質(zhì)的各種組成成分，而且還能降解其它蛋白酶、細胞外受體、生長因子、趨化因子、細

2、胞因子結合蛋白等物質(zhì)，所以，基質(zhì)金屬蛋白酶參與了許多重要的生理和病理過程。體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶表達水平和活性的升高與癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移、粥狀動脈硬化的形成、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和敗血癥的惡化等有著緊密的關系，已經(jīng)證明基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一些成員是治療上述疾病的藥物靶點。所以對基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的研究與開發(fā)對于治療癌癥、粥狀動脈硬化、神經(jīng)退行性疾病和敗血癥等疾病具有重要的意義。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶由疏水信號肽序列、前肽區(qū)、催化結構域、

3、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)5部分組成，其中單獨的催化結構域與完整蛋白酶的催化活性相似。本實驗利用原核表達系統(tǒng)成功表達MMP-3的催化結構域蛋白和MMP-8的催化結構域蛋白，并通過Ni-NTA親和層析柱和肝素親和層析柱對重組蛋白進行了純化，得到了可用于高通量藥物篩選的蛋白。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法測定了重組蛋白的活性，選定了合適的底物濃度和蛋白濃度，從而建立了穩(wěn)定的高通量藥物篩選體系，為以后的MMP-3和MMP-8的高通量藥物篩選奠