老化免疫研究——小鼠胸腺增齡相關(guān)新基因IH-1的功能研究和抗氧化植物的篩選.pdf

1、胸腺增齡性退化與萎縮是機(jī)體老化過程中最重要的免疫系統(tǒng)表現(xiàn)，可能是決定和制約免疫系統(tǒng)老化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而胸腺萎縮的調(diào)控機(jī)制至今尚不清楚。晚近的研究表明，胸腺萎縮過程伴隨著基因表達(dá)的改變，基因表型不同的個體其胸腺萎縮的速度和程度存在明顯的差異。因此，我們推測，胸腺萎縮是一個受遺傳基因調(diào)控的過程，其中基因的變化或基因間相互作用可能共同導(dǎo)致胸腺萎縮。此外，本課題組以往的研究資料表明，氧化應(yīng)激狀態(tài)下小鼠胸腺的結(jié)構(gòu)和功能受到明顯損害，并出現(xiàn)衰老的跡

2、象，這提示氧化損傷可能參與了胸腺萎縮的過程。 本研究旨在進(jìn)一步闡明胸腺萎縮的基因調(diào)控機(jī)制以及尋找延緩胸腺萎縮和改善免疫功能的有效方法。首先，我們利用生物信息學(xué)、酵母雙雜交和蛋白質(zhì)相互作用驗(yàn)證等技術(shù)，對已獲得的胸腺增齡相關(guān)新基因IH-1的功能進(jìn)行了研究，初步明確了IH-1基因所具有的生物學(xué)功能，并探討了其與胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞分化發(fā)育的關(guān)系；其次，利用體外抗氧化檢測技術(shù)和氧化應(yīng)激模型小鼠，對41種天然植物的抗氧化作用進(jìn)行體內(nèi)外篩選，獲

3、得了數(shù)種具有較強(qiáng)抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能的植物，最終為延緩胸腺萎縮和免疫老化的控制提供新的思路和手段。 本研究完成的主要工作及其結(jié)果如下：一、小鼠胸腺增齡相關(guān)新基因IH-1的功能研究1、分析了IH-1基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)IH-1基因cDNA全長1001bp，含一個732bp的完整開放閱讀框(71～802)，編碼一個具有243個氨基酸、分子量約為28KD的蛋白質(zhì)。我們首先利用SMART軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域搜索，發(fā)現(xiàn)在IH-1基因編碼產(chǎn)物的第10～

4、114氨基酸處有一個RWD結(jié)構(gòu)域，雖然該結(jié)構(gòu)域的功能未見明確報(bào)道，但有分析資料顯示RWD結(jié)構(gòu)域可能與細(xì)胞內(nèi)的泛素-蛋白酶體代謝途徑有關(guān)。對蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果表明，IH-1基因編碼蛋白具有糖基化修飾位點(diǎn)、SUMO序列修飾位點(diǎn)以及多個潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)。 2、觀察了IH-1基因在胸腺及脾臟中的表達(dá)及分布為了確定IH-1基因在不同發(fā)育階段胸腺細(xì)胞和成熟T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平，我們首先分離胸腺細(xì)胞和脾臟細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分

5、選技術(shù)獲得各發(fā)育階段T淋巴細(xì)胞。隨后采用RT-PCR方法對IH-1基因的表達(dá)情況進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明CD4-CD8-雙陰性(DN)細(xì)胞和CD8+單陽性(SP)細(xì)胞中IH-1基因表達(dá)水平較高；而IH-1基因在CD4+CD8+雙陽性(DP)細(xì)胞和CD4+單陽性(SP)細(xì)胞中的表達(dá)水平較低；成熟T淋巴細(xì)胞中也有IH-1基因的表達(dá)。 3、利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選到與IH-1基因編碼產(chǎn)物相互作用的蛋白分子，并對蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證

6、我們構(gòu)建了用于酵母雙雜交的1月齡小鼠胸腺pGADcDNA文庫，并以IH-1基因編碼產(chǎn)物全長作為“誘餌”蛋白對文庫進(jìn)行了篩選，結(jié)果獲得兩個在酵母細(xì)胞中與IH-1基因編碼產(chǎn)物相互作用的蛋白分子：UbB(UbiquitinB)和Nedd8(Neuralprecursorcellexpressed，developmentallydown-regulatedgene8)。結(jié)合我們前期的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們初步認(rèn)為IH-1基因編碼蛋白可能與Ub

7、B、Nedd8以及RACK1(Receptor1forActivatedC-Kinases)相互作用。 4、初步探討了IH-1基因編碼蛋白與NF-κB活性之間的關(guān)系我們采用NF-κB熒光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IH-1基因編碼蛋白能夠活化NF-κB，并且存在一定的劑量依賴關(guān)系。為了尋找該傳導(dǎo)通路的細(xì)胞外信號，我們用IL-1β進(jìn)行細(xì)胞外刺激，結(jié)果表明IL-1β能增強(qiáng)IH-1基因編碼蛋白對NF-κB的活化作用，并且也有劑量依賴

8、性。 二、41種天然植物體內(nèi)外抗氧化作用的研究 1、完成了41種天然植物體外抗氧化作用的研究 采用除羥基實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子生成抑制實(shí)驗(yàn)、大鼠腹腔巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)抑制實(shí)驗(yàn)及DNA氧化損傷抑制實(shí)驗(yàn)，對41種天然植物的抗氧化作用進(jìn)行了體外篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)植物具有不同程度的抗氧化作用，其中有13種植物在體外的抗氧化作用強(qiáng)于或相當(dāng)于維生素C或維生素E，它們是水溶性植物兒茶素(Catechin)、茶多酚(Cathechin)

9、、綠茶(Greentea)、紅茶(Blacktea)、烏龍茶(Oolongtea)、丁香(Clove)、覆盆子(Bilberry)、葡萄籽(Grapeseed)和西伯利亞人參(Siberianginseng)；脂溶性植物銀杏(Ginkgo)、樹脂(Propolis)、迷迭香(Rosemary)和鼠尾草(Sage)。另外，我們將這些植物進(jìn)行搭配組合(如丁香+覆盆子)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合后的作用效果與單一植物的作用無顯著差異。 2、完成了

10、13種天然植物體內(nèi)抗氧化及免疫調(diào)節(jié)功能的研究 在體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們選擇出效果良好的13種植物，利用氧化應(yīng)激小鼠模型研究這些植物在體內(nèi)的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多數(shù)植物具有明顯的抗氧化及調(diào)節(jié)免疫作用，但是與維生素C或維生素E相比，其效果欠佳。結(jié)果如下：兒茶素、丁香、銀杏、茶多酚、烏龍茶、綠茶和樹脂具有較為穩(wěn)定的抗氧化及改善免疫功能的作用；覆盆子在體內(nèi)能改善免疫功能，但其抗氧化效果相對較弱；丁香+覆盆子組方也表現(xiàn)出有效的抗

11、氧化和免疫保護(hù)作用；紅茶、迷迭香和鼠尾草也具有一定的抗氧化作用，但效果均較弱；西伯利亞人參在體內(nèi)的作用效果較差可能與其增強(qiáng)機(jī)體代謝水平有關(guān)。 綜上，本研究產(chǎn)生以下結(jié)論：1)IH-1基因編碼蛋白可能作為信號傳導(dǎo)分子，在胸腺細(xì)胞內(nèi)與泛素及泛素樣蛋白相互作用，通過泛素化代謝過程參與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，從而促進(jìn)胸腺細(xì)胞的分化發(fā)育。但是，IH-1基因增齡性表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)理以及其與胸腺萎縮的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究；2)篩選出數(shù)種兼具有