DADS活化HL-60細(xì)胞G-,2--M檢查點(diǎn)與cyclinB1亞細(xì)胞分布和p21的關(guān)系.pdf

1、研究背景DADS是從大蒜中分離出的脂溶性單體有機(jī)硫化合物，可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯等方式抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。前期的研究顯示：DADS能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G2/M期，但機(jī)制尚不完全清楚。cyclinB1是細(xì)胞周期G2/M期的特異性周期素，是唯一隨細(xì)胞周期變化而發(fā)生亞細(xì)胞分布改變的細(xì)胞周期素，cyclinB1的核轉(zhuǎn)位是啟動(dòng)細(xì)胞有絲分裂的必要條件。p21是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(cycledependent

2、kinase，CDK)抑制劑，可與CDK、cyclinB1和增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)形成四元復(fù)合物，在細(xì)胞周期推進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明：p21與cyclinB1誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期生長(zhǎng)阻滯可能涉及如下兩種機(jī)制：形成p21-PCNA-cdc2/cyclinB1四元復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性抑制cdc25與PCAN結(jié)合，阻斷cdc25催化cdc2去磷酸化；這種四元復(fù)合物阻斷cdc2活

3、化激酶(cdc2activatingkinase，CAK)磷酸化cdc2，以上兩種機(jī)制協(xié)同抑制cdc2激酶的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期生長(zhǎng)阻滯。但是迄今為止，cyclinB1亞細(xì)胞分布和p21在DADS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M期生長(zhǎng)阻滯中的作用尚未得到證實(shí)。方法用20μMDADS處理HL-60細(xì)胞，MTT法測(cè)定DADS對(duì)HL-60細(xì)胞增殖活性的影響，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定DADS對(duì)細(xì)胞增殖周期的影響，Westernblot測(cè)定DADS對(duì)cyclinB

4、1亞細(xì)胞分布、p21與c-myc的表達(dá)水平的影響，免疫共沉淀分析cyclinB1與p21兩者相互作用，重組質(zhì)粒pcDNA3-c-myc和對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3分別轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)、Westernblot以及丫啶橙染色法檢測(cè)p21受到抑制后，DADS對(duì)細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞命運(yùn)的影響。結(jié)果為了探討DADS對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響，經(jīng)20μMDADS、DMSO、及10nM全反式維甲酸(ATRA)孵育HL-60細(xì)胞24h，結(jié)果顯

5、示：DADS能抑制HL-60細(xì)胞增殖，20μMDADS對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率與ATRA(10nM)對(duì)細(xì)胞的抑制率接近。為了確定DADS阻滯HL-60細(xì)胞周期時(shí)相，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示：DADS處理HL-60細(xì)胞12h，G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)平均值上升到最大值(37.6％)。提示：DADS能抑制HL-60細(xì)胞增殖并活化細(xì)胞增殖周期G2/M期檢測(cè)點(diǎn)。　　Cdc2/cyclinB1是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的始動(dòng)因素，且cyclinB1

6、核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞啟動(dòng)有絲分裂必要條件，為了探討cyclinB1的亞細(xì)胞分布與DADS誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期生長(zhǎng)阻滯的關(guān)系，用20μMDADS處理HL-60細(xì)胞。結(jié)果顯示：cyclinB1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，DADS處理HL-60細(xì)胞12h，細(xì)胞質(zhì)cyclinB1表達(dá)達(dá)到高峰，而此時(shí)細(xì)胞核cyclinB1表達(dá)明顯受到抑制。提示：cyclinB1胞質(zhì)定位與DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞G2/M期檢查點(diǎn)有關(guān)?！　榱颂接憄21在DADS啟動(dòng)G2/M期檢查點(diǎn)中

7、的作用，20μMDADS處理HL-60細(xì)胞0h～24h。結(jié)果顯示：DADS能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞p21表達(dá)，至12h時(shí)達(dá)高峰。為了解p21與cyclinB1的存在狀態(tài)及相互作用，用抗cyclinB1抗體沉淀DADS處理12h的HL-60細(xì)胞總蛋白，經(jīng)ProteinA/GPLUS-Agarose處理，用抗p21單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡。結(jié)果顯示：cyclinB1能被p21抗體沉淀，p21與cyclinB1以復(fù)合物的形式存在

8、，p21通過(guò)與cyclinB1結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。這些結(jié)果提示：p21可能與DADS啟動(dòng)HL-60細(xì)胞G2/M期檢查點(diǎn)有關(guān)?！　榱诉M(jìn)一步證實(shí)p21在DADS活化HL-60細(xì)胞G2/M檢查點(diǎn)中的作用，將pcDNA3-c-myc和pcDNA3分別轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染c-myc質(zhì)粒的HL-60細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)c-Myc，此時(shí)轉(zhuǎn)染c-myc質(zhì)粒的HL-60細(xì)胞p21表達(dá)降低。提示：c-Myc能夠抑制DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞

9、p21表達(dá)。為了探討c-Myc下調(diào)p21的表達(dá)對(duì)DADS啟動(dòng)HL-60細(xì)胞G2/M期檢查點(diǎn)的作用，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示：DADS處理上述細(xì)胞12h后，c-myc轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降到22.7％，而空質(zhì)粒pcDNA轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞G2/期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為37.6％，并且，未加DADS處理HL-60細(xì)胞G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為20.3％。這些結(jié)果提示：當(dāng)c-Myc內(nèi)源性表達(dá)上調(diào)抑制HL-60細(xì)胞p21

10、的表達(dá)時(shí)，能逆轉(zhuǎn)DADS誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞的G2/M期阻滯?！　榱诉M(jìn)一步確定c-Myc下調(diào)p21的表達(dá)對(duì)HL-60細(xì)胞命運(yùn)的影響，采用丫啶橙染色觀察HL-60細(xì)胞凋亡形態(tài)。結(jié)果顯示：DADS處理c-myc轉(zhuǎn)染12h的HL-60細(xì)胞呈現(xiàn)明顯凋亡特征：細(xì)胞膜以及核膜保持完整，細(xì)胞核濃縮。上述結(jié)果提示：當(dāng)c-Myc內(nèi)源性表達(dá)上調(diào)抑制p21表達(dá)時(shí)，DADS能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。結(jié)論1.DADS活化HL-60細(xì)胞G2/M期檢查點(diǎn)與cy