人工合成的吡咯咪唑聚酰胺對(duì)人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子基因的識(shí)別及其對(duì)啟動(dòng)子活性和基因表達(dá)的影響.pdf

1、反義技術(shù)是基因治療策略中常用的一種方法，包括反義DNA、反義RNA、和核酶(ribozysome)。然而，它們?cè)隗w內(nèi)易被核酸酶降解，且需要特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。因此，新型藥物的研制成為基因治療發(fā)展的方向。人工合成的吡咯咪唑聚酰胺(PIP)是由五元雜環(huán)化合物N．甲基吡咯(Py)和N．甲基咪唑(Im)組成，經(jīng)酰胺鍵連接的芳香族氨基酸多聚體。研究表明PIP能在雙螺旋DNA小溝處與特異性核酸序列緊密結(jié)合，影響基因表達(dá)；同時(shí)，PIP可抵抗核酸酶的降解，

2、不需要特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。因此，PIP將成為一種切實(shí)可行的基因治療藥物。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是新近發(fā)現(xiàn)致纖維化病變的主要發(fā)病因子。作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-p)的下游介質(zhì)，CTGF促進(jìn)纖維母細(xì)胞增殖、DNA合成和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成，它的過(guò)度表達(dá)對(duì)纖維化的形成起主要作用。在許多進(jìn)展性腎病的腎組織中，尤其是在伴有細(xì)胞增生和ECM蓄積的腎小球系膜和小管間質(zhì)病變區(qū)，CTGF表達(dá)量明顯增加。因此，CTGF表達(dá)顯著增加是增生性或纖維化性

3、’腎臟病變中一種普遍現(xiàn)象。CTGF在腎纖維化中的重要作用已成為目前防治慢性腎臟病研究領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)。為了尋找一種有效的基因失活劑來(lái)治療進(jìn)展性腎病，我們?cè)O(shè)計(jì)和合成了識(shí)別人類(lèi)CTGF(hCTGF)基因啟動(dòng)子的PIP，并驗(yàn)證它的特異性結(jié)合、在培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞(HMCs)中的分布以及對(duì)HMCsCTGF基因表達(dá)的影響，為PIP治療包括進(jìn)展性腎病在內(nèi)的CTGF相關(guān)性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題分為三個(gè)部分。 第一部分：PIP的特異性識(shí)別和細(xì)胞

4、分布 設(shè)計(jì)的PIP結(jié)合于hCTGF啟動(dòng)子一157到一15Ibp之間(靠近Smads結(jié)合位點(diǎn))。PIP采用固相合成法。根據(jù)hCTGF啟動(dòng)子序列，人工合成PIP識(shí)別DNA片段：位于hCTGF啟動(dòng)子上游-175至-144之間的32個(gè)堿基對(duì)。這32個(gè)堿基對(duì)包括假想的PIP結(jié)合位點(diǎn)和Smad結(jié)合位點(diǎn)。正義鏈DNA用γ-32P標(biāo)記。通過(guò)與反義鏈DNA結(jié)合形成γ-32P雙鏈DNA(dsDNA)和無(wú)標(biāo)記dsDNA。γ-32PdsDNA(10pM

5、)、PIP(10nM)及無(wú)標(biāo)記dsDNA(100pM、1000pM)兩者或三者結(jié)合后，分5道在20％PAGE進(jìn)行凝膠遷移試驗(yàn)：γ-32P單鏈DNA(ssDNA)、γ-32PdsDNA(10pM)、PIP結(jié)合γ-32PdsDNA、PIP結(jié)合γ-32PdsDNA及1O×無(wú)標(biāo)記dsDNA(100pM)、PIP結(jié)合γ-32PdsDNA及l(fā)00×無(wú)標(biāo)記dsDNA(1000pM)。凝膠遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示與PIP結(jié)合的γ-32PdsDNA出現(xiàn)電泳滯后現(xiàn)

6、象。加入未標(biāo)記dsDNA可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PIP，從而減少了與γ-32PdsDNA結(jié)合的PIP數(shù)量，削弱了凝膠電泳出現(xiàn)的滯后現(xiàn)象，并且隨著未標(biāo)記dsDNA濃度的提高，凝膠電泳滯后現(xiàn)象越來(lái)越弱。HMCs在含有l(wèi)nM熒光素標(biāo)記FITC-PIP的RPMI．1640中培養(yǎng)2小時(shí)。細(xì)胞漂洗后，一部分細(xì)胞用4％多聚甲醛固定10分鐘；另一部分加入新鮮RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)22h，經(jīng)細(xì)胞漂洗后用4％多聚甲醛固定10分鐘。固定的細(xì)胞在熒光顯微鏡的暗視野和明

7、視野下觀察、攝片獲取圖像，并通過(guò)圖像處理合成暗視野和明視野重疊圖像。然后用核染料Hoechst33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色再觀察。結(jié)果顯示PIP在HMCs細(xì)胞核內(nèi)聚集分布，培養(yǎng)2小時(shí)后已濃聚于細(xì)胞核內(nèi)，可維持24小時(shí)。 第二部分：hCTGF啟動(dòng)子質(zhì)粒的構(gòu)建及PIP對(duì)啟動(dòng)子活性的影響 從健康人全血中提取人基因組DNA，以人基因組DNA為模板，用PCR方法獲得hCTGF啟動(dòng)子序列片段2225bp(-2183至+42bp之間，轉(zhuǎn)

8、錄起始點(diǎn)為+1)。把hCTGF啟動(dòng)子片段DNA插入含熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒pGL3-Bascic，構(gòu)建pGL3-hCTGF重組質(zhì)粒，并經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定。0．5gg重組質(zhì)粒pGL3-hCTGF和0．01μg內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒phRG-TK共轉(zhuǎn)染HMCs4小時(shí)后分別用TGF-β1和豆蔻酸佛波酰乙酯(PMA)在有或無(wú)PIP干預(yù)下共培養(yǎng)24小時(shí)，然后用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)測(cè)定hCTGF啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGL3-hCTGF

9、經(jīng)過(guò)酶切和DNA測(cè)序鑒定，證實(shí)其包含hCTGF啟動(dòng)子序列2225bp片段。重組質(zhì)粒pGL3-hCTGF轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的HMCs，可表達(dá)熒光素酶活性。其活性被PMA和TGF-β1上調(diào)，而被PIP抑制。 第三部分：PIP對(duì)HMCsCTGF基因表達(dá)的影響 HMCs分別在TGF-β1和PMA刺激下，加入不同濃度的PIP共培養(yǎng)，用RT-PCR和WesternBlot方法測(cè)定CTGFmRNA及蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)的HMCs加入1gMPMA刺激

10、12h或5ng／mlTGF-βl刺激6h，CTGFmRNA表達(dá)顯著增加。0.01μM、0．1μM和1gMPIP提前6h干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)，可明顯抑制CTGFmRNA的表達(dá)，且呈濃度依賴(lài)關(guān)系。HMCs加入1gMPMA刺激12h或5ng／mlTGF-β1刺激6h，CTGF蛋白表達(dá)顯著增加。1μMPIP提前6h干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)，可明顯抑制CTGF蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和合成的PIP可特異性識(shí)別hCTGF啟動(dòng)子DNA序列，并能穿透細(xì)胞膜和