瘦素基因甲基化與妊娠期糖尿病糖代謝紊亂的實驗研究.pdf

1、研究背景
　　 妊娠期糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus，GDM)是妊娠期發(fā)生糖尿病者(已知有糖尿病而合并妊娠者不包括在內(nèi))，主要表現(xiàn)為餐后血糖的異常升高及高胰島素血癥。GDM作為孕期特有的會對母兒造成嚴重影響的疾病越來越受到重視，對其發(fā)病機制的研究多數(shù)著眼于胰島素水平的升高及胰島素抵抗，而隨著對肥胖因子瘦素功能的認識，發(fā)現(xiàn)很多組織中瘦素都與胰島素存在著雙向調(diào)節(jié)作用。在妊娠期糖尿病患者，無論是母體

2、還是宮內(nèi)的胎兒還存在瘦素的高表達及明顯的瘦素抵抗。因此，近年來瘦素在GDM中的作用越來越受到重視。
　　 甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種修飾方式，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下使胞嘧啶轉(zhuǎn)變成甲基胞嘧啶(5-mC)的化學(xué)修飾過程，可以通過抑制DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)序列的結(jié)合、參與基因沉默過程、影響基因轉(zhuǎn)錄的延伸過程等方式降低基因的表達。位于人類7號染色體的瘦素基因，其啟動子區(qū)為組織特異性甲基區(qū)，甲基化程度負性調(diào)控著基因的表達。
　

3、　 本課題旨在通過選用合適的GDM動物模型檢測正常鼠及GDM鼠孕前、不同孕期及產(chǎn)后糖代謝、血清中胰島素和瘦素的水平、肝臟和胎盤組織中瘦素表達與其基因啟動子區(qū)甲基化的關(guān)系。并進一步探索絨毛滋養(yǎng)細胞中瘦素基因啟動子區(qū)的甲基化及瘦素的表達水平是否受孕激素的影響，為妊娠期糖尿病的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。
　　 目的
　　 了解瘦素基因啟動子區(qū)甲基化與妊娠期糖尿病糖代謝異常的關(guān)系，從表觀遺傳學(xué)角度探索妊娠期糖尿病的發(fā)病機制。

4、>　　 方法
　　 1、比較C57BL/Ksj Lepr db/+小鼠和正常的C57BL/Ksj鼠孕前、不同孕期及產(chǎn)后的糖耐量及各期血清中胰島素、瘦素的水平，并對C57BL/Ksj Lepr db/+小鼠能否作為妊娠期糖尿病動物模型進行可行性分析；
　　 2、Western Blot法測定正常鼠與GDM鼠孕前、不同孕期、產(chǎn)后瘦素在肝臟組織中的表達和不同孕期胎盤組織中的表達水平，同時了解兩種組織中瘦素基因啟動子區(qū)甲基化情

5、況與瘦素表達的相關(guān)性；
　　 3、不同孕激素濃度下培養(yǎng)人滋養(yǎng)層細胞，了解孕激素對滋養(yǎng)層細胞瘦素基因啟動子區(qū)的甲基化及瘦素表達的影響。
　　 結(jié)果
　　 實驗一：1.C57BL/Ksj db/+孕鼠較正常孕鼠糖耐量明顯降低，空腹胰島素水平隨孕期進展明顯升高(P<0.05)，且顯著高于同期正常孕鼠，產(chǎn)后恢復(fù)正常；(2)C57BL/Ksjdb/+孕鼠血清中瘦素明顯高于非孕期(P<0.05)，但中孕以后與孕齡無明顯相關(guān)性

6、。
　　 實驗二：1.正常孕鼠肝臟組織中瘦素的表達高于未孕期(P<0.05)，妊娠各期之間差異不顯著(P>0.05)，產(chǎn)后降低；而胎盤組織中瘦素的表達隨妊娠進展明顯增高(P<0.05)；C57BL/Ksj db/+孕鼠肝臟及胎盤組織中瘦素的表達都高于同期正常孕鼠(P<0.05)；2.正常及C57BL/Ksj db/+孕鼠肝臟組織中瘦素基因啟動子區(qū)甲基化水平與非孕期相比無明顯變化；C57BL/Ksj db/+孕鼠胎盤組織中瘦素基因

7、啟動子區(qū)的甲基化水平明顯低于正常孕鼠。
　　 實驗三：1.體外培養(yǎng)的人早孕滋養(yǎng)層細胞早期呈現(xiàn)圓形或類圓形狀態(tài)，隨著細胞平鋪生長，表現(xiàn)為多邊形或長梭形，免疫組化結(jié)果顯示角蛋白染色陽性、波形蛋白染色陰性的細胞接近95%，可用于后續(xù)研究；2.滋養(yǎng)層細胞中瘦素基因啟動子區(qū)的甲基化水平隨培養(yǎng)液中孕酮水平的升高而降低；3.滋養(yǎng)層細胞表達瘦素的水平與孕酮的濃度呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1.C57BL/Ksj db/+雌鼠糖