BMP9對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HS-5相互作用的影響.pdf

1、目的:研究BMP9對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HS-5相互作用的影響及其分子機(jī)制。
　　方法:采用Transwell小室共培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞與HS-5細(xì)胞，AdBMP9、AdGFP分別感染HCT116細(xì)胞，收集各組的條件培養(yǎng)基加入共培養(yǎng)體系中。分別以MDA-MB-231+HS-5為空白組、以MDA-MB-231+HS-5+GFP為對(duì)照組、以MDA-MB-231+HS-5+BMP9為實(shí)驗(yàn)組。
　

2、　對(duì)于共培養(yǎng)體系中的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移及侵襲能力;Real Time PCR檢測(cè)遷移和侵襲相關(guān)基因(IL-6、IL-8、IL-11、PTH-rp、RANK、RANKL、MMP2、C-myc、CXCR4、MMP9)mRNA的表達(dá)改變;westem blot檢測(cè)IL-6、PTH-rp、MMP9蛋白與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路蛋白(p-P38、P38、p-ERK1/2、ERK1/2

3、、p-JNK1/2、JNK1/2、p-AKT、AKT、pGSK-3β、GSK-3β、β-catenin)的表達(dá)變化。
　　對(duì)于共培養(yǎng)體系中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HS-5，采用化學(xué)發(fā)光法、細(xì)胞化學(xué)染色法、茜素紅S染色法及MTT分別檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)活性、ALP表達(dá)、細(xì)胞鈣鹽沉積及其增殖的變化;RT-PCR方法及Westernblot方法觀察骨鈣素(OCN)、骨橋蛋白(OPN)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和骨保護(hù)素(O

4、PG) mRNA和蛋白表達(dá)的變化;Real Time PCR檢測(cè)調(diào)控MAPK、AKT信號(hào)通路相關(guān)基因(IL-6、IL-8、RANKL)mRNA的表達(dá)改變。
　　通過ELISA技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中RANKL的濃度，在含有BMP9蛋白條件培養(yǎng)基中加入濃度為6ng/ml的OPG抗體，即分別以MDA-MB-231+HS-5+BMP9為空白組，以MDA-MB-231+HS-5+BMP9+IgG為對(duì)照組，以MDA-MB-231+HS-5+BM

5、P9+OPG抗體為實(shí)驗(yàn)組，觀察各組中MDA-MB-231遷移、侵襲能力以及AKT信號(hào)通路的改變。
　　結(jié)果:AdBMP9感染HCT116細(xì)胞后，其條件培養(yǎng)基中含有BMP9蛋白，AdGFP感染HCT116細(xì)胞后獲得的條件培養(yǎng)基中則不含有BMP9蛋白。分別將條件培養(yǎng)基加入共培養(yǎng)體系后，以共培養(yǎng)體系中的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組的24h細(xì)胞劃痕愈合率為（28.4±0.7）％，顯著少于對(duì)照組（78.3±3.2）％(P

6、＜0.05）;穿膜細(xì)胞數(shù)為(169.0±12.5)個(gè)，顯著少于對(duì)照組(408.7±17.2)個(gè)(P＜0.05); IL-6、PTH-rp和MMP9的mRNA表達(dá)量分別下降43％、38％和51％(P＜0.05)，IL-8、C-myc和CXCR4的mRNA表達(dá)量分別升高113％、97％和164％(P＜0.05)，而IL-11和RANK的mRNA表達(dá)量變化不大(P＞0.05)，RANKL不表達(dá);PTH-rP、IL-6及MMP9的蛋白表達(dá)量下降

7、;p-P38蛋白在30min、1h時(shí)表達(dá)量下降;p-ERK1/2蛋白在1h時(shí)表達(dá)量下降;p-JNK1/2蛋白在6h時(shí)表達(dá)量下降;p-AKT蛋白在15min、30min、1h時(shí)表達(dá)量下降;PGSK-3β蛋白在12h時(shí)表達(dá)量下降;而β-catenin蛋白在6h時(shí)表達(dá)量升高。
　　以共培養(yǎng)體系中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HS-5為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組的ALP活性升高，并呈時(shí)間依賴性，第9天達(dá)最高，隨后降低;ALP細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn);成

8、骨指標(biāo)OCN、OPN的mRNA和蛋白表達(dá)都升高，鈣鹽沉積增多;第3天時(shí)細(xì)胞增殖能力升高明顯，其后增殖能力升高更明顯;RANKL的mRNA表達(dá)水平下降54％(P＜0.05)，而IL-8、IL-6的mRNA表達(dá)水平分別升高39％、212％(P＜0.05);在mRNA和蛋白表達(dá)水平上，實(shí)驗(yàn)組OPG與β-actin灰度比值分別為(0.335±0.042、0.332±0.055)，均顯著高于對(duì)照組(0.048±0.008、0.126±0.020)

9、(P＜0.05)，而RANKL與β-actin灰度比值分別為(0.036±0.004、0.055±0.006)，均顯著低于對(duì)照組(0.070±0.008、0.099±0.034)(P＜0.05)。
　　與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)體系中RANKL的含量下降;向含有BMP9蛋白的共培養(yǎng)體系中加入濃度為6ng/ml的OPG抗體，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中MDA-MB-231細(xì)胞的AKT信號(hào)得到恢復(fù)，細(xì)胞侵襲能力減弱，但遷移能力無變化。