單個(gè)蛋白分子的測(cè)定及配體與受體在細(xì)胞表面結(jié)合和運(yùn)動(dòng)的研究.pdf

1、本文第一章對(duì)單分子檢測(cè)(SMD)的意義及常用的單分子檢測(cè)技術(shù)作了簡(jiǎn)單介紹。SMD技術(shù)在生命科學(xué)上的應(yīng)用可以在單分子水平上揭示分子的動(dòng)態(tài)行為、動(dòng)力學(xué)過(guò)程和機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)大量分子集合體中分子個(gè)體的性質(zhì)和行為。這一章中我們對(duì)在生物大分子SMD中應(yīng)用較為廣泛的技術(shù)：全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRFM)的原理等進(jìn)行了介紹。對(duì)TIRFM用于分子馬達(dá)的運(yùn)動(dòng)、分子間相互作用、生物大分子的構(gòu)象變化等離體生物單分子探測(cè)作了詳細(xì)的綜述。對(duì)TIRFM用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、、細(xì)胞趨化性、離子通道等在體生物單分子探測(cè)作了詳細(xì)的綜述。 第二章中我們建立了一種新的、靈敏的全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRFM)的基于蛋白與玻片之間達(dá)到吸附平衡的單分子檢測(cè)(SMD)定量方法。在我們的工作之前文獻(xiàn)中用TIRFM檢測(cè)了羅丹明6G分子和羅丹明6G標(biāo)記的DNA分子，檢測(cè)限僅2.5 × 109 mol/L.我們用Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)(Alexa Fluor 488 goat anti-

3、rat IgG(H+L)，IgG(H+L)-488)作為檢測(cè)蛋白.首先將IgG(H+L)-488在蓋玻片上孵育一定時(shí)間。IgG(H+L)-488在溶液和玻片之間達(dá)到吸附平衡后。使用安裝有電子多級(jí)放大電感偶合器(electronmultiplying charge coupled device，EMCCD)的TIRFM拍攝IgG(H+L)-488的熒光圖像。圖像中熒光點(diǎn)的數(shù)目為隱失場(chǎng)中IgG(H+L)-488分子吸附在蓋玻片上的數(shù)目和溶液

4、中的數(shù)目的總和。當(dāng)溶液的濃度在5.4×10-11～8.1×10-10 mol/L之間時(shí)，圖像中熒光點(diǎn)的數(shù)目與溶液中的IgG(H+L)-488濃度有良好的線性關(guān)系。線性范圍的下限比文獻(xiàn)報(bào)道的低了46倍。此部分內(nèi)容已發(fā)表在Anal.Chim。Acta雜志上。 第三章中我們?cè)趩畏肿铀綄?duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白與細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程早期階段進(jìn)行了研究。轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是生物體細(xì)胞最具特點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程之一.轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)

5、鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的早期階段包括質(zhì)膜上轉(zhuǎn)鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物(TfR-Tf)的運(yùn)動(dòng)、聚集以及內(nèi)涵體的形成等，這些現(xiàn)象曾用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)等方法進(jìn)行研究，但大多將大量細(xì)胞溶解后通過(guò)直接測(cè)量放射性標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物的強(qiáng)度進(jìn)行判斷。由于受大量細(xì)胞平均化檢測(cè)方法的限制，無(wú)法動(dòng)態(tài)觀察這些過(guò)程。在本章中我們以單分子檢測(cè)方法中靈敏度高、對(duì)樣品損傷小的細(xì)胞內(nèi)TIRFM為主要檢測(cè)方式，對(duì)下列過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的觀察。 1.實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察了溶液中

6、Tf-QD被質(zhì)膜上。TfR捕獲的過(guò)程。 2.在實(shí)時(shí)追蹤質(zhì)膜上TfR-Tf的聚集過(guò)程時(shí)，觀察到了質(zhì)膜上TfR-Tf通過(guò)擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)與質(zhì)膜上另一個(gè)已形成的TfR-Tf復(fù)合體聚集的過(guò)程。 3.在4℃下和37℃下通過(guò)觀測(cè)熒光點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)來(lái)分析細(xì)胞膜上的TfR-Tf復(fù)合物及其側(cè)向運(yùn)動(dòng)，觀測(cè)到人的胃癌細(xì)胞膜上的TfP.在4℃和37℃時(shí)擴(kuò)散的方式有自由擴(kuò)散和受限擴(kuò)散形式。并且通過(guò)熒光點(diǎn)的連續(xù)移動(dòng)對(duì)應(yīng)于照片中的像素坐標(biāo)分別計(jì)算出了兩個(gè)溫度下Tf

7、R-Tf復(fù)合體的瞬時(shí)擴(kuò)散系數(shù)。 上述在單分子水平上的研究結(jié)果，目前均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。 在第四章中我們?cè)讦?-腎上腺素受體的拮抗劑-藥物小分子哌唑嗪(prazosin)和α1-腎上腺素受體的激動(dòng)劑-去氧腎上腺素(phenylephrine)鍵合上生物素(biotin).利用生物素與鏈酶親和素(streptavidin)之間極強(qiáng)的親和力將鏈酶親和素包被的量子點(diǎn)(QD-streptavidin)標(biāo)記到哌唑嗪和去氧腎上腺素上，并用

8、于觀察此兩藥物小分子與活細(xì)胞表面α1A-腎上腺素受體結(jié)合的情況。由于量子點(diǎn)獨(dú)特的優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)，近年來(lái)用量子點(diǎn)標(biāo)記藥物小分子及用于細(xì)胞成像已有報(bào)道。然而，他們利用多步化學(xué)鍵合反應(yīng)將藥物小分子連接到量子點(diǎn)上的方法存在反應(yīng)產(chǎn)率低及分離提純等問(wèn)題。而且用這種方法很難控制連接到量子點(diǎn)上藥物小分子的數(shù)目。另一種思路是首先將生物素連接到藥物小分子(生物素化藥物小分子)，這些生物素化藥物小分子然后與QD-streptavidin反應(yīng)將生物素化藥物小分子

9、結(jié)合到量子點(diǎn)上。文獻(xiàn)也報(bào)道了用這種思路將多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的拮抗劑結(jié)合到量子點(diǎn)上，但未用于細(xì)胞的熒光成像。根據(jù)這種背景我們進(jìn)行了下列的研究工作： 1.用與文獻(xiàn)完全不同的合成路線將生物素與藥物小分子哌唑嗪和去氧腎上腺素鍵合在一起，再與QD-streptavidin反應(yīng)將量子點(diǎn)標(biāo)記到哌唑嗪和去氧腎上腺素。這種標(biāo)記量子點(diǎn)的方法克服了文獻(xiàn)中化學(xué)鍵合反應(yīng)標(biāo)記法存在的反應(yīng)產(chǎn)率低及分離提純等問(wèn)題，而且還可以控制每個(gè)量子點(diǎn)上連接到量子點(diǎn)上藥物小分子

10、的數(shù)目，因?yàn)槊總€(gè)量子點(diǎn)上包被的鏈酶親和素的量是一定的。由于QD-streptavidin已有商品，所以我們這種標(biāo)記量子點(diǎn)的方法十分方便，有利于在生命科學(xué)的研究中應(yīng)用。研究結(jié)果證明用這種方法標(biāo)記量子點(diǎn)的哌唑嗪和去氧腎上腺素仍具有藥理活性，可用于細(xì)胞的熒光成像。 2.研究了去氧腎上腺素與生物素之間連接不同鏈長(zhǎng)的化合物時(shí)去氧腎上腺素與細(xì)胞表面α1A-腎上腺素受體結(jié)合的情況。發(fā)現(xiàn)在生物素與去氧腎上腺素之間的鏈越長(zhǎng)，越易于與細(xì)胞表面α1A-腎上腺