家蠶卵黃原蛋白受體(BmVgR)與配體結(jié)合及解離機(jī)制的初探.pdf

1、昆蟲(chóng)卵黃原蛋白受體(Vitellogenin receptor，VgR)屬于低密度脂蛋白受體，主要功能是通過(guò)胞吞作用介導(dǎo)卵黃原蛋白(Vitellogenin，Vg)進(jìn)入卵巢，為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。目前為止，已經(jīng)報(bào)道了21種昆蟲(chóng)VgR的cDNA及基因組序列，它們都具有典型的LDLR保守功能結(jié)構(gòu)域。本小組已經(jīng)報(bào)道了家蠶卵黃原蛋白受體（BmVgR）基因位于第20號(hào)染色體上，全長(zhǎng)cDNA為5746bp。BmVgR作為卵巢特異的蛋白在雌性家蠶

2、個(gè)體的整個(gè)生命周期中都有表達(dá)。家蠶vit突變體的產(chǎn)生是因?yàn)樵撈贩N的BmVgR基因缺失了一段150bp的編碼序列，導(dǎo)致編碼的BmVgR蛋白功能異常而不能正常轉(zhuǎn)運(yùn)卵黃蛋白，最終導(dǎo)致后期胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)缺乏而致死。同時(shí)，采用RNAi干涉正常雌性家蠶BmVgR，同樣發(fā)現(xiàn)BmVgR基因下調(diào)對(duì)卵巢的發(fā)育產(chǎn)生了影響，即卵子不能形成或產(chǎn)生畸形卵，表明BmVgR在家蠶卵巢發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用。本研究在獲得家蠶卵黃原蛋白受體全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上，利用基因克隆

3、、原核表達(dá)、細(xì)胞表達(dá)、免疫組化、免疫共沉淀、Far-Western blotting等技術(shù)對(duì)家蠶的卵黃原蛋白受體的功能進(jìn)行了初步探討，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶卵黃原蛋白受體的結(jié)構(gòu)分析與克隆
　　 對(duì)已報(bào)道的21種昆蟲(chóng)卵黃原蛋白受體進(jìn)行信息分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)21種昆蟲(chóng)物種的VgR結(jié)構(gòu)圖譜幾乎一致，都具有兩個(gè)拷貝的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD1、LBD2)和表皮生長(zhǎng)因子前體同源區(qū)域(EGFP1、EGFP2)。BmVgR與已報(bào)

4、道的兩種蠶蛾科昆蟲(chóng)(柞蠶(ApVgR)和絹絲蠶(AsVgR))的結(jié)構(gòu)組成形式是一樣的。將昆蟲(chóng)卵黃原蛋白受體進(jìn)行進(jìn)化分析顯示，BmVgR與鱗翅目昆蟲(chóng)VgRs關(guān)系最近，聚為一簇;且蠶蛾科的家蠶、柞蠶及絹絲蠶的同源性最高，這與傳統(tǒng)的物種進(jìn)化關(guān)系一致?？寺mVgR的LBD1和LBD2后，對(duì)其氨基酸序列分析顯示:LBD1由4個(gè)配體結(jié)合重復(fù)區(qū)(LBRs)組成，并且每個(gè)LBR含有6個(gè)半胱氨酸殘基;對(duì)LBD2的克隆發(fā)現(xiàn)LBD2具有5種不同拼接形式，即

5、LBD2-(1～5)，其中LBD2-2、LBD2-3及LBD2-4三種拼接形式表現(xiàn)為插入一段氨基酸序列，而LBD2-5則缺失了一段氨基酸序列。對(duì)LBD1和LBD2-(1～5)的氨基酸序列進(jìn)行翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)LBD1和LBD2-(1～5)都存在磷酸化位點(diǎn)，但只有LBD2-(1～5)存在糖基化位點(diǎn)。
　　 2.家蠶卵黃原蛋白和卵黃原蛋白受體抗體的制備
　　 對(duì)BmVg的ND肽段（N端含有大亞基的部分結(jié)構(gòu)域）和BmVg

6、R的YWTD肽段（EGFP1的部分結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行克隆后原核表達(dá)，都是以包涵體形式表達(dá)了蛋白，對(duì)表達(dá)蛋白采用親和鎳柱純化，其純化蛋白由抗體公司免疫兔子得到了抗兔的多克隆抗體。BmVg和BmVgR抗體效價(jià)都大于1:512000，濃度分別為0.4mg/mL和0.26mg/mL，經(jīng)抗原檢測(cè)BmVg和BmVgR多克隆抗體都能較特異的結(jié)合相應(yīng)抗原，這為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)做好了準(zhǔn)備。
　　 3.家蠶初期蛹血液中卵黃原蛋白的純化
　　 將家蠶初期

7、蛹血液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀后，利用SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BmVg主要集中在40％～60％的硫酸銨飽和溶液組分中，對(duì)該組分采用陰離子交換層析，經(jīng)過(guò)蛋白透析、濃縮，最終得到了較純的蛋白，即濃度為0.1mg/mL。用BmVg多克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)純化后的BmVg蛋白，結(jié)果蛋白條帶單一，且蛋白分子量大小與預(yù)期一致。由此，確認(rèn)了所純化獲得的蛋白的確是BmVg，且純度達(dá)到了后續(xù)BmVgR結(jié)合實(shí)驗(yàn)要求。
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8、.家蠶卵黃原蛋白受體與卵黃原蛋白的結(jié)合與解離
　　 構(gòu)建了分別含野生型和vit突變型家蠶卵黃原蛋白受體的第一個(gè)拷貝的功能域即包含了信號(hào)肽、第一個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一個(gè)表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域(SP+LBD1+EGF1)的細(xì)胞表達(dá)載體(p50:C11D，d50:C11V)。轉(zhuǎn)染到草地貪夜蛾Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞系中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果目的蛋白主要分泌在細(xì)胞培養(yǎng)液中。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果C11V和C11D蛋白在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞系中的表達(dá)量相當(dāng)，二者并沒(méi)

9、有明顯差異，說(shuō)明vit突變體的BmVgR在細(xì)胞水平上是可以正常表達(dá)的。為了能確定一個(gè)BmVgR和BmVg在體外解離的pH值，本研究先確認(rèn)了BmVgR和BmVg解離的生物環(huán)境的pH值，即對(duì)不同蠶卵pH值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果蠶卵內(nèi)的pH值顯示卵內(nèi)的生物環(huán)境一般為酸性，即在5.1～6.3。將在Sf9細(xì)胞中表達(dá)獲得的C11D和C11V蛋白分別與純化的BmVg進(jìn)行免疫共沉淀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中性環(huán)境中，C11D和C11V蛋白的結(jié)構(gòu)域都能結(jié)合BmVg;在酸性環(huán)

10、境中，BmVg能從正常的C11D結(jié)構(gòu)域蛋白上解離，但幾乎不能從突變的C11V結(jié)構(gòu)域蛋白上解離，說(shuō)明vit突變體中BmVgR的第一個(gè)EGF的第三個(gè)ClassB的缺失對(duì)BmVgR結(jié)合配體蛋白沒(méi)有影響，但在生理酸性條件下是不能與配體解離，最終導(dǎo)致突變體vit卵中缺乏BmVg蛋白。
　　 5.家蠶卵黃原蛋白受體與不同配體的相互作用
　　 對(duì)BmVgR的LBD1和LBD2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建，并在Sf9細(xì)胞中表達(dá)。將表達(dá)蛋白