家蠶卵黃原蛋白受體(BmVgR)與配體結(jié)合及解離機制的初探.pdf

1、昆蟲卵黃原蛋白受體(Vitellogenin receptor，VgR)屬于低密度脂蛋白受體，主要功能是通過胞吞作用介導卵黃原蛋白(Vitellogenin，Vg)進入卵巢，為卵母細胞的發(fā)育提供營養(yǎng)。目前為止，已經(jīng)報道了21種昆蟲VgR的cDNA及基因組序列，它們都具有典型的LDLR保守功能結(jié)構(gòu)域。本小組已經(jīng)報道了家蠶卵黃原蛋白受體（BmVgR）基因位于第20號染色體上，全長cDNA為5746bp。BmVgR作為卵巢特異的蛋白在雌性家蠶

2、個體的整個生命周期中都有表達。家蠶vit突變體的產(chǎn)生是因為該品種的BmVgR基因缺失了一段150bp的編碼序列，導致編碼的BmVgR蛋白功能異常而不能正常轉(zhuǎn)運卵黃蛋白，最終導致后期胚胎發(fā)育的營養(yǎng)缺乏而致死。同時，采用RNAi干涉正常雌性家蠶BmVgR，同樣發(fā)現(xiàn)BmVgR基因下調(diào)對卵巢的發(fā)育產(chǎn)生了影響，即卵子不能形成或產(chǎn)生畸形卵，表明BmVgR在家蠶卵巢發(fā)育過程中具有重要的作用。本研究在獲得家蠶卵黃原蛋白受體全長序列的基礎(chǔ)上，利用基因克隆

3、、原核表達、細胞表達、免疫組化、免疫共沉淀、Far-Western blotting等技術(shù)對家蠶的卵黃原蛋白受體的功能進行了初步探討，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶卵黃原蛋白受體的結(jié)構(gòu)分析與克隆
　　 對已報道的21種昆蟲卵黃原蛋白受體進行信息分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)21種昆蟲物種的VgR結(jié)構(gòu)圖譜幾乎一致，都具有兩個拷貝的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD1、LBD2)和表皮生長因子前體同源區(qū)域(EGFP1、EGFP2)。BmVgR與已報

4、道的兩種蠶蛾科昆蟲(柞蠶(ApVgR)和絹絲蠶(AsVgR))的結(jié)構(gòu)組成形式是一樣的。將昆蟲卵黃原蛋白受體進行進化分析顯示，BmVgR與鱗翅目昆蟲VgRs關(guān)系最近，聚為一簇;且蠶蛾科的家蠶、柞蠶及絹絲蠶的同源性最高，這與傳統(tǒng)的物種進化關(guān)系一致?？寺mVgR的LBD1和LBD2后，對其氨基酸序列分析顯示:LBD1由4個配體結(jié)合重復區(qū)(LBRs)組成，并且每個LBR含有6個半胱氨酸殘基;對LBD2的克隆發(fā)現(xiàn)LBD2具有5種不同拼接形式，即

5、LBD2-(1～5)，其中LBD2-2、LBD2-3及LBD2-4三種拼接形式表現(xiàn)為插入一段氨基酸序列，而LBD2-5則缺失了一段氨基酸序列。對LBD1和LBD2-(1～5)的氨基酸序列進行翻譯后修飾位點預測，發(fā)現(xiàn)LBD1和LBD2-(1～5)都存在磷酸化位點，但只有LBD2-(1～5)存在糖基化位點。
　　 2.家蠶卵黃原蛋白和卵黃原蛋白受體抗體的制備
　　 對BmVg的ND肽段（N端含有大亞基的部分結(jié)構(gòu)域）和BmVg

6、R的YWTD肽段（EGFP1的部分結(jié)構(gòu)域）進行克隆后原核表達，都是以包涵體形式表達了蛋白，對表達蛋白采用親和鎳柱純化，其純化蛋白由抗體公司免疫兔子得到了抗兔的多克隆抗體。BmVg和BmVgR抗體效價都大于1:512000，濃度分別為0.4mg/mL和0.26mg/mL，經(jīng)抗原檢測BmVg和BmVgR多克隆抗體都能較特異的結(jié)合相應抗原，這為后續(xù)的實驗做好了準備。
　　 3.家蠶初期蛹血液中卵黃原蛋白的純化
　　 將家蠶初期

7、蛹血液進行硫酸銨分級沉淀后，利用SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)BmVg主要集中在40％～60％的硫酸銨飽和溶液組分中，對該組分采用陰離子交換層析，經(jīng)過蛋白透析、濃縮，最終得到了較純的蛋白，即濃度為0.1mg/mL。用BmVg多克隆抗體進行Western blotting檢測純化后的BmVg蛋白，結(jié)果蛋白條帶單一，且蛋白分子量大小與預期一致。由此，確認了所純化獲得的蛋白的確是BmVg，且純度達到了后續(xù)BmVgR結(jié)合實驗要求。
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8、.家蠶卵黃原蛋白受體與卵黃原蛋白的結(jié)合與解離
　　 構(gòu)建了分別含野生型和vit突變型家蠶卵黃原蛋白受體的第一個拷貝的功能域即包含了信號肽、第一個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一個表皮生長因子結(jié)構(gòu)域(SP+LBD1+EGF1)的細胞表達載體(p50:C11D，d50:C11V)。轉(zhuǎn)染到草地貪夜蛾Sf9昆蟲細胞系中進行表達，結(jié)果目的蛋白主要分泌在細胞培養(yǎng)液中。通過免疫熒光檢測，結(jié)果C11V和C11D蛋白在Sf9昆蟲細胞系中的表達量相當，二者并沒

9、有明顯差異，說明vit突變體的BmVgR在細胞水平上是可以正常表達的。為了能確定一個BmVgR和BmVg在體外解離的pH值，本研究先確認了BmVgR和BmVg解離的生物環(huán)境的pH值，即對不同蠶卵pH值進行測定，結(jié)果蠶卵內(nèi)的pH值顯示卵內(nèi)的生物環(huán)境一般為酸性，即在5.1～6.3。將在Sf9細胞中表達獲得的C11D和C11V蛋白分別與純化的BmVg進行免疫共沉淀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中性環(huán)境中，C11D和C11V蛋白的結(jié)構(gòu)域都能結(jié)合BmVg;在酸性環(huán)

10、境中，BmVg能從正常的C11D結(jié)構(gòu)域蛋白上解離，但幾乎不能從突變的C11V結(jié)構(gòu)域蛋白上解離，說明vit突變體中BmVgR的第一個EGF的第三個ClassB的缺失對BmVgR結(jié)合配體蛋白沒有影響，但在生理酸性條件下是不能與配體解離，最終導致突變體vit卵中缺乏BmVg蛋白。
　　 5.家蠶卵黃原蛋白受體與不同配體的相互作用
　　 對BmVgR的LBD1和LBD2結(jié)構(gòu)域進行細胞表達載體構(gòu)建，并在Sf9細胞中表達。將表達蛋白