極低密度脂蛋白受體影響細(xì)胞增殖遷移的非配體依賴作用的研究.pdf

1、極低密度脂蛋白受體(very low density lipoprotein receptor,VLDLR)是低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)超家族成員之一。由于第16號(hào)外顯子的選擇性剪接，產(chǎn)生兩種不同亞型，分別為含O-linked糖鏈結(jié)合域的Ⅰ型VLDLR和不含此結(jié)構(gòu)的Ⅱ型VLDLR。近些年研究發(fā)現(xiàn)，VLDLR除了參與脂質(zhì)代謝外，還可結(jié)合多種配體及細(xì)胞信號(hào)分子，進(jìn)而影響細(xì)胞

2、生物學(xué)行為。本室前期對(duì)VLDLR的研究過程中發(fā)現(xiàn)，胃腺癌細(xì)胞SGC7901與影響細(xì)胞增殖遷移的配體(uPA-PAI-1、TFPI)結(jié)合時(shí)，細(xì)胞增殖遷移能力改變的同時(shí)伴有細(xì)胞VLDLR亞型表達(dá)量的改變。促進(jìn)細(xì)胞增殖的配體上調(diào)了Ⅱ型VLDLR表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖的配體則使Ⅰ型VLDLR表達(dá)增加；誘導(dǎo)細(xì)胞向不同方向分化時(shí)，在無配體存在時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了上述現(xiàn)象，提示VLDLR可能存在非配體依賴作用。為了進(jìn)一步研究VLDLR影響細(xì)胞生物學(xué)行為是否存在非

3、配體依賴機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)主要通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Ⅰ型VLDLR或Ⅱ型VLDLR的ldl-A7細(xì)胞株，檢測(cè)VLDLR亞型對(duì)細(xì)胞增殖遷移能力的影響，并初步探討其可能存在的信號(hào)途徑。
　　 我們利用前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)構(gòu)建的兩種VLDLR真核表達(dá)載體pCD-VR1和pCD-VR2,采用Lipofectamine2000介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染ldl-A7細(xì)胞株，通過G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)Ⅰ型VLDLR或Ⅱ型VLDLR的ldl-A7細(xì)胞，并經(jīng)RT-PCR，W

4、estern Blotting 鑒定。細(xì)胞模型構(gòu)建成功后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力變化。并用Western blotting檢測(cè)信號(hào)分子ERK，p-ERK蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 穩(wěn)定表達(dá)VLDLR亞型的細(xì)胞模型經(jīng)RT-PCR、Western Blotting 鑒定，ldl-A7-VLDLRⅠ細(xì)胞分別于336bp和130KD附近出現(xiàn)條帶，而ldl-A7-VLDLRⅡ細(xì)胞則于252

5、bp和105KD附近出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，提示VLDLR亞型細(xì)胞模型構(gòu)建成功。MTT和Transwell小室法實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型VLDLR的細(xì)胞株增殖遷移能力較對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染ldl-A7)明顯增強(qiáng)，而穩(wěn)定表達(dá)Ⅰ型VLDLR的ldl-A7細(xì)胞增殖遷移能力則較對(duì)照組有所降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩型VLDLR在細(xì)胞增殖遷移中發(fā)揮非配體依賴作用，Ⅱ型VLDLR促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移，而Ⅰ型VLDLR則可能抑制細(xì)胞的增殖遷移。對(duì)ERK、p-ERK的