脂蛋白脂酶在人系膜細(xì)胞攝取極低密度脂蛋白中作用的探討.pdf

1、背景：高脂血癥能加速腎臟病進(jìn)展的觀點(diǎn)已被越來越多的學(xué)者所證實(shí)，但大多研究主要集中在高膽固醇血癥與腎功能損害的關(guān)系。近年來有證據(jù)提示極低密度脂蛋白(verylow-densitylipoprotein，VLDL)可能參與腎小球硬化的發(fā)病過程中。脂質(zhì)積聚和泡沫細(xì)胞形成被認(rèn)為是脂質(zhì)介導(dǎo)的腎小球和小管間質(zhì)損害的特征。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)VLDL可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞變?yōu)榕菽?xì)胞。然而VLDL誘導(dǎo)系膜細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚及導(dǎo)致腎損害的機(jī)制目前還不是很清楚。有研究顯示表

2、達(dá)在動脈壁的脂蛋白脂酶(lipoproteinlipase，LPL)可通過其酶解作用和分子橋作用促進(jìn)富含甘油三酯的脂蛋白的攝取，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成。腎小球系膜細(xì)胞也可表達(dá)脂蛋白脂酶，但關(guān)于它在腎臟的病理生理作用罕有研究。從人類和動物實(shí)驗(yàn)的許多觀察強(qiáng)烈提示脂質(zhì)介導(dǎo)的腎損害的發(fā)病機(jī)制與動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制有許多相似之處，那么在腎小球系膜區(qū)表達(dá)的LPL能否發(fā)揮類似的作用促進(jìn)脂質(zhì)腎損害的進(jìn)展值得探討。本研究旨在探討LPL在人系膜細(xì)胞攝取V

3、LDL中的作用及可能的機(jī)制；并進(jìn)一步觀察與此相關(guān)的一些病理生理效應(yīng)，就LPL在VLDL介導(dǎo)。腎損害中的作用機(jī)制進(jìn)行探討。 方法：本研究使用人腎小球系膜細(xì)胞系(HMCLs)為研究對象。 1、LPL在系膜細(xì)胞攝取VLDL中的作用通過過表達(dá)和抑制兩方面的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討： (1)將攜帶野生型人LPL基因(hLPLwt)，無活性的突變型人LPL基因(hLPL194)和對照人堿性磷酸酶基因(hAP)的重組腺病毒轉(zhuǎn)染人腎小球系膜

4、細(xì)胞(HMCLs)，建立高表達(dá)活性型和非活性型脂蛋白脂酶的HMCLs。 (2)orlistat(奧利司他)是一種內(nèi)源性LPL脂酶活性的抑制劑，用于LPL酶活性阻斷試驗(yàn)。Heparinase(肝素酶)是一類能特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，能阻斷LPL分子橋作用的發(fā)揮?？筁DLr和LRP抗體被用于封閉脂蛋白受體。 (3)RT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)和放射性同位素脂質(zhì)體底物法分別檢測LPLmRNA、蛋白和酶活性的水平；油

5、紅O染色和酶法分別定性和定量檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況；GPOTrinder法檢測細(xì)胞上清中甘油的含量。 2、LPL在VLDL誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞損傷中作用的探討： (1)LPL的過表達(dá)和抑制通過上述類似的方法實(shí)現(xiàn)。 (2)MTT法檢測VLDL對HMCLs增殖的影響；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和ELISA法檢測HMCLsMCP-1mRNA和蛋白表達(dá)的水平；通過HMCLs在高VLDL刺激后與THP-1單核細(xì)胞的共孵育，檢測了單

6、核細(xì)胞的趨化情況。 結(jié)果 1、LPL在系膜細(xì)胞攝取VLDL中的作用： (1)VLDL能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，且在一定范圍內(nèi)具有時(shí)間和濃度依賴性。在此種條件下，細(xì)胞內(nèi)積聚的脂質(zhì)以甘油三酯為主。 (2)人腎小球系膜細(xì)胞可表達(dá)脂蛋白脂酶，并具有活性。 (3)活性型和非活性型LPL過表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示：①三種重組腺病毒感染HMCLs，LPL活性檢測顯示：感染Ad-hLPLwt的HMCLs細(xì)胞上清液中LPL

7、活性較對照組明顯升高(40.5±0.57U/Lversus1.35±0.15U/L，P＜0.01)，而Ad-hLPL194組LPL活性與對照組無顯著差異(1.48±0.12U/Lversus1.35±0.15U/L，P＞0.05)。本結(jié)果說明HMCLs能被重組腺病毒感染并有效表達(dá)LPL。②重組腺病毒感染的HMCLs孵育在高VLDL(40μg/ml)環(huán)境中6小時(shí)后，油紅0染色顯示：對照組細(xì)胞內(nèi)幾乎見不到紅染的脂質(zhì)顆粒沉積，而Ad-hLPL

8、wt組細(xì)胞內(nèi)可見許多粗大紅色顆粒，Ad-hLPL194組細(xì)胞內(nèi)僅見一些散在細(xì)小紅色脂質(zhì)顆粒沉積。酶法分析示Ad-hLPLwt組和Ad-hLPL194組細(xì)胞內(nèi)積聚的甘油三酯較對照組明顯增多(109.11±5.01μg/mgproteinand36.33±2.64μg/mgproteinversus23.98±3.23μg/mgprotein，P＜0.01andP＜0.05)，三組的細(xì)胞內(nèi)膽固醇成分無顯著差異(P＞0.05)。③三組細(xì)胞上清

9、中甘油的測定顯示Ad-hLPLwt組細(xì)胞上清中甘油含量較Ad-hAP對照組明顯增多(P＜0.01)，而Ad-hLPL194組和Ad-hAP對照組細(xì)胞上清中甘油含量無明顯差別。 (4)LPL酶活性阻斷試驗(yàn)顯示：①Orlistat劑量(0.1-10μM)依賴性地抑制了系膜細(xì)胞LPL的活性。②Orlistat劑量依賴性地抑制了VLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積聚。10μMOrlistat組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量較對照組明顯下降(34.671

10、22±0.8934μg/mgproteinversus84.4054±1.7319μg/mgprotein，P＜0.01)。③Orlistat劑量依賴性地減少了細(xì)胞上清中甘油的含量。 (5)LPL分子橋阻斷試驗(yàn)顯示：預(yù)孵育heparinase的HMCLs組與對照組比較，在較高的VLDL刺激時(shí)，輕度減少了細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積聚。LDLr和LRP的封閉未明顯減少VLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積聚。 2、LPL在VLDL誘導(dǎo)的系

11、膜細(xì)胞損傷中作用的探討： (1)在一定范圍內(nèi)，VLDL可時(shí)間劑量依賴性地促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖和上調(diào)系膜細(xì)胞MCP-1的表達(dá)，繼而增加系膜細(xì)胞對THP-1單核細(xì)胞的趨化。 (2)LPL過表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示：①相同條件的脂質(zhì)處理后，Ad-hLPLwt組細(xì)胞上清較對照組對HMCLs的增殖作用明顯增強(qiáng)(0.2282±0.0168versus0.1805±0.0254，P＜0.05)，Ad-hLPL194組和Ad-hAP組之間比較無顯著差

12、異(0.1825±0.0298versus0.1805±0.0254，P=0.051)。②與Ad-hAP對照組相比，Ad-hLPLwt組細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)上調(diào)39％(P＜0.05)，蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)(為對照的2.18倍，P＜0.01)。Ad-hLPLwt組對THP-1單核細(xì)胞的趨化能力最強(qiáng)，為對照組的1.69倍(P＜0.05)。Ad-hLPL194組和Ad-hAP組兩者之間無顯著差異。 (3)LPL酶活性阻斷試驗(yàn)顯示：

13、①HMCLs在100μg/mlVLDL孵育24h，orlistat可劑量依賴性地抑制VLDL對HMCLs細(xì)胞的增殖效應(yīng)，10μM組與DMSO對照組相比，系膜細(xì)胞增殖下降30％(P＜0.05)。②Orlistat可劑量依賴性地抑制VLDL刺激的HMCLs細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)和蛋白的分泌。 (4)VLDL能時(shí)間(0-16h)和劑量(0-100μg/ml)依賴性地輕度上調(diào)系膜細(xì)胞LPL的表達(dá)。 結(jié)論 (1)VLD

14、L能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，且具有時(shí)間和濃度依賴性。在此種條件下，細(xì)胞內(nèi)積聚的脂質(zhì)以甘油三酯為主。 (2)人腎小球系膜細(xì)胞可表達(dá)脂蛋白脂酶，并具有活性。 (3)LPL在人系膜細(xì)胞攝取VLDL的過程中具有重要作用，其中酶的活性是主要方面。 (4)VLDL在一定范圍內(nèi)能時(shí)間劑量依賴性地刺激系膜細(xì)胞增殖和MCP-1上調(diào)，在這一過程中LPL可能發(fā)揮著重要作用。 (5)VLDL在一定范圍內(nèi)能時(shí)間劑量依賴性地輕度