AQP5對(duì)人呼吸道黏膜下腺細(xì)胞水跨膜通透性及粘蛋白合成、分泌影響的研究.pdf

1、第一部分目的：旨在探討質(zhì)粒介導(dǎo)的短發(fā)夾狀RNA(shRNA，shorthairpinRNA)對(duì)人呼吸道粘膜下腺細(xì)胞(SPC-A1)水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)表達(dá)的抑制。 方法：用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)AQP5和MUC5AC在SPC-A1細(xì)胞上的表達(dá)。構(gòu)建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)shAQP5重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞。用熒光定量PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)，用FACS和Western雜交檢測(cè)蛋白表達(dá)。 結(jié)果：

2、AQP5和MUC5AC在SPC-A1上均有表達(dá)。與未轉(zhuǎn)染組(Con)和無(wú)關(guān)轉(zhuǎn)染組(shNeg)比較，shAQP5組細(xì)胞AQP5mRNA表達(dá)在轉(zhuǎn)染后l、2天明顯降低，3—7天mRNA水平有輕度回調(diào)，而蛋白的明顯抑制出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第5天。 結(jié)論：質(zhì)粒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(shRNA)可有效抑制人呼吸道黏膜下腺細(xì)胞膜AQP5的表達(dá)，AQP5蛋白水平的抑制滯后于mRNA水平。若能將RNA干擾用于AQPs的其它亞型將拓展AQPs生理功能的研究

3、。 第二部分目的：shRNA介導(dǎo)的AQP5的抑制是否影響SPC-A1細(xì)胞滲透壓驅(qū)動(dòng)的水跨膜通透性。 方法：細(xì)胞分3組即Con組，shNeg組，shAQP5組。用標(biāo)記胞漿的熒光染料Calcein-AM負(fù)載SPC-A1細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同滲透壓溶液灌流時(shí)的熒光變化曲線(xiàn)，根據(jù)公式計(jì)算各組滲透壓驅(qū)動(dòng)的水通透系數(shù)(Osmoticwaterpermeabilitycoefficient，Pf)。將細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間置于低滲液

4、中，觀察各組細(xì)胞調(diào)節(jié)性體積收縮(Regulatedvolumedecrease，RVD)現(xiàn)象的異同。 結(jié)果：用5個(gè)系列梯度的Calcein-AM負(fù)載細(xì)胞多次灌流實(shí)驗(yàn)均未觀察到SPC-A1細(xì)胞的Calcein-AM淬滅現(xiàn)象。熒光強(qiáng)度與細(xì)胞體積的關(guān)系為：隨著滲透壓增高，細(xì)胞體積縮小，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；滲透壓降低，細(xì)胞體積增大，熒光強(qiáng)度減弱。shAQP5組細(xì)胞灌流高滲液后熒光強(qiáng)度的上升支較Con組和shNeg組緩慢，根據(jù)公式計(jì)算的Pf為0

5、．8×10～cm／s，與Con組比較下降49．4％。shAQP5組細(xì)胞的RVD時(shí)間明顯延長(zhǎng)，最大回縮能力為85％，較Con組和shNeg組明顯降低。 結(jié)論：共聚焦顯微鏡可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度和細(xì)胞體積，是研究水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的理想方法。AQP5抑制后可明顯降低SPC-A1細(xì)胞滲透壓驅(qū)動(dòng)下水的通透性，還可影響細(xì)胞在低滲環(huán)境中的調(diào)節(jié)性體積回縮能力。 第三部分目的：AQP5下調(diào)是否影響人呼吸道黏膜下腺細(xì)胞粘蛋白(MUC5AC)的合成和分

6、泌，若兩者確實(shí)存在某種調(diào)節(jié)關(guān)系，則進(jìn)一步探討AQP5和MUC5AC之間調(diào)控的分子機(jī)制。 方法：構(gòu)建能在體內(nèi)表達(dá)針對(duì)AQP5的短發(fā)夾狀RNA(shAQP5)的重組質(zhì)粒。用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shAQP5的細(xì)胞克隆。MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)水平用Real-timePCR及Western雜交檢測(cè)。用ELISA法檢測(cè)3組細(xì)胞(Con，shNeg，shAQP5)上清及裂解液中MUC5AC的合成和分泌。用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)靜息及激發(fā)

7、狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。3組細(xì)胞PKC及p-PKC水平差異用Western雜交檢測(cè)。 結(jié)果：G418處理1．5月后，篩出的5個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定證實(shí)插入序列已整合在細(xì)胞基因組上。pShAQP5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染3～4天，MUC5ACmRNA分別增高120％和65．7％，ELISA顯示瞬轉(zhuǎn)第5天，MUC5AC的合成和分泌分別增加57．9％、85．3％。在5株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中fshAQP5-G1,G2,G3,A1,A5)MUC5ACm

8、RNA分別升高¨8％，165％，65％，123％和38％。ELISA檢測(cè)MUC5AC的合成和分泌分別增加59．156％及33—166％。shAQP5組的【Ca2+]i在靜息狀態(tài)與Con組無(wú)明顯變化，但pilocarpine激發(fā)下明顯增高。shAQP5組細(xì)胞PKC水平與Con組比較無(wú)明顯變化，但p-PKC的表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性升高。 結(jié)論：AQP5抑制可上調(diào)SPC-A1細(xì)胞MUC5AC的合成和分泌，并可能是通過(guò)Ca2+一PKC信號(hào)通路