尼膜同對大鼠彌漫性軸索損傷后腦含水量、BBB通透性及AQP4表達(dá)的影響.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)是一種常見的顱腦損傷類型，其特點(diǎn)是癥狀危重、昏迷時間長、傷殘率及死亡率高。DAI的形成包括一系列病理生理學(xué)變化過程，除了剪應(yīng)力直接作用形成的原發(fā)性損傷外，腦損傷后的繼發(fā)性改變?nèi)缛毖?、缺氧、水腫等引起的損傷更為嚴(yán)重。伴隨DAI產(chǎn)生的血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞，及由之引起的腦水腫等繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致本病預(yù)后較差的主要原因。近年來發(fā)現(xiàn)的

2、水通道蛋白4(Aquaporin-4，AQP4)與DAI后腦水腫的形成關(guān)系密切，但AQP4是否引起B(yǎng)BB通透性的改變，以及Ca2+是否與二者有關(guān)聯(lián)尚不清楚。研究證明在大鼠腦出血模型中，Ca2+拮抗劑尼膜同能夠下調(diào)腦組織AQP4 mRNA表達(dá)，降低BBB通透性，從而抑制腦水腫。本實(shí)驗(yàn)擬通過動態(tài)觀察大鼠DAI后腦組織含水量、BBB通透性和AQP4的表達(dá)，以及使用尼膜同后的變化，探討DAI后腦水腫的發(fā)生機(jī)制，從而為DAI防治提供理論依據(jù)。

3、 方法：健康雄性成年SD大鼠110只，體重350-375g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。按完全隨機(jī)分組原則分為3組：對照組、DAI組和尼膜同治療組。對照組10只，DAI組和尼膜同治療組各50只。后兩組再各隨機(jī)分為6h、1d、3d、5d、7d組5個亞組，每個亞組10只大鼠。DAI組按照Marmarou等的方法制作大鼠DAI模型；尼膜同治療組腹腔注射尼膜同(0.5mg/kg體重)20min后，按照Marmarou等的方法制作大鼠DA

4、I模型，以后每24h注射1次尼膜同(劑量同前)；對照組大鼠切開頭皮暴露顱骨后直接縫合。造模后大鼠常規(guī)進(jìn)食。從DAI組和尼膜同治療組每個亞組中隨機(jī)抽取五只大鼠，連同從對照組中隨機(jī)抽取的五只大鼠，按預(yù)定時間，4％多聚甲醛溶液灌注后斷頭取腦，沿正中矢狀線將腦組織分為左右兩部分。左半腦組織立即進(jìn)行腦組織含水量的測定；右半腦組織常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋后連續(xù)切片厚度4μm，進(jìn)行相應(yīng)染色、觀察。取上述各時間點(diǎn)的左半腦組織，采用干濕重法計(jì)算腦組

5、織含水量，以此代表腦水腫的程度。 各組中剩余的大鼠均采用分光光度法檢測各時間點(diǎn)的腦組織中伊文思蘭(evens blue，EB)的含量，以定量評價(jià)BBB功能損害的情況。 在光鏡下，通過對標(biāo)本的HE染色觀察DAI后腦水腫的變化，如細(xì)胞水腫、細(xì)胞間隙和血管周圍間隙增寬程度等。通過對標(biāo)本的免疫組化染色觀察細(xì)胞胞膜呈棕黃色或褐色深染的AQP4蛋白陽性表達(dá)。采用Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量分析每個視野陽性目標(biāo)平均吸光度值

6、(OD)，代表AQP4的表達(dá)強(qiáng)度。 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差分析有顯著性差異時，進(jìn)一步用q檢驗(yàn)作兩兩比較；以及根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作直線相關(guān)性分析。以P＜0.05作為判斷差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 1.肉眼及光鏡觀察結(jié)果肉眼觀察：DAI組和尼膜同治療組可見軟腦膜血管擴(kuò)張淤血，散在的點(diǎn)灶狀蛛網(wǎng)膜下腔出血，

7、未見明顯的腦挫傷及腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血；HE染色：DAI組可見腦組織疏松水腫，細(xì)胞空泡樣變，細(xì)胞間隙和血管周圍間隙增寬。尼膜同治療組病理變化較DAI組輕。對照組無上述病理變化；免疫組化染色：DAI組可見室管膜、軟腦膜和血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜呈棕黃色或褐色深染的AQP4陽性表達(dá)。尼膜同治療組AQP4表達(dá)較DAI組稍弱，但強(qiáng)于對照組。對照組AQP4呈弱陽性表達(dá)。 2.腦組織含水量的變化DAI組和尼膜同治療組腦組織含水量均呈現(xiàn)一個由低向高

8、，到達(dá)頂峰后逐漸降低的過程。從致傷后6h開始增加，1d達(dá)到高峰，之后開始下降，7d腦組織含水量仍高于正常。與對照組比較，DAI組和尼膜同治療組都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＜0.05)。尼膜同治療組達(dá)到高峰時間與DAI組相同，但6h、1d、3d、5d腦組織含水量均低于DAI組(P＜0.05)，7d腦組織含水量無明顯差異(P＞0.05)。 3.BBB通透性的變化(EB含量的變化)DAI組和尼膜同治療組BBB通透性均呈現(xiàn)一個逐漸上升，到達(dá)頂峰

9、后緩慢降低的過程。從致傷后6h開始升高，1d～3d時最高(1d與3d比較無明顯差異)，之后逐漸降低，7天BBB通透性仍高于正常。與對照組比較，DAI組和尼膜同治療組都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＜0.05)。尼膜同治療組的變化與DAI組相似，但各對應(yīng)時間點(diǎn)BBB通透性均低于DAI組(P＜0.05)。 4 腦組織AQP4表達(dá)的變化DAI組和尼膜同治療組腦組織AQP4表達(dá)均呈現(xiàn)一個由低向高，到達(dá)頂峰后逐漸降低的過程。從致傷后6h開始增加，3d

10、達(dá)到高峰，之后開始下降，7d腦組織AOP4表達(dá)仍高于正常。與對照組比較，DAI組和尼膜同治療組都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＜0.05)。尼膜同治療組達(dá)到高峰時間與DAI組相同，但各對應(yīng)時間點(diǎn)AQP4表達(dá)均低于DAI組(P＜0.05)。 5 腦含水量、EB含量、AQP4表達(dá)的相關(guān)分析大鼠DAI后腦含水量、EB含量與AQP4表達(dá)的變化規(guī)律一致，相關(guān)分析顯示腦含水量與AQP4表達(dá)正相關(guān)(r=0.824，P＜0.01)；EB含量與AQP4表達(dá)也

11、呈正相關(guān)(r=0.871，P＜0.01)。 結(jié)論： 1.大鼠DAI后腦組織含水量、BBB通透性、AQP4表達(dá)均呈現(xiàn)一個由低向高，到達(dá)頂峰后開始逐漸降低的過程。AQP4蛋白的變化規(guī)律，與腦組織含水量、BBB通透性呈正相關(guān)，證實(shí)AQP4與DAI后腦水腫的形成，BBB損傷之間存在密切正相關(guān)關(guān)系。 2.給予尼膜同治療后，與DAI組相比，腦組織含水量、BBB通透性、AQP4表達(dá)在各對應(yīng)時間點(diǎn)均有明顯的差異(P＜0.05)。