大鼠彌漫性軸索損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化與IL-6的表達(dá).pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)是指在頭部遭受直線加速性或(和)旋轉(zhuǎn)性暴力打擊時(shí)，腦組織由于加速運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生剪切、伸展和壓縮應(yīng)力，導(dǎo)致腦白質(zhì)廣泛發(fā)生以神經(jīng)軸索損傷為特征的一系列病理生理變化。意識(shí)障礙是其典型的表現(xiàn)，臨床診斷較困難，預(yù)后多差。近年來研究發(fā)現(xiàn)，彌漫性軸索損傷造成外傷后的腦功能障礙不僅是由于最初的機(jī)械外力對(duì)組織的剪切、積壓等造成的，更是由于損傷后數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天中發(fā)生的復(fù)雜的“二次打擊”造

2、成的。以往的研究主要集中在損傷后神經(jīng)元的變化，近年有研究發(fā)現(xiàn)外傷性腦損傷(traumic brain injury,TBI)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生，且隨時(shí)間的變化而變化。 小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。小膠質(zhì)細(xì)胞也是一種可塑性細(xì)胞，不僅能釋放神經(jīng)生長因子，也能釋放神經(jīng)毒因子，其保護(hù)作用和損傷神經(jīng)元的效應(yīng)依賴于周圍環(huán)境及活化因子的變化。有實(shí)驗(yàn)表明，小膠質(zhì)細(xì)

3、胞是第一個(gè)針對(duì)損傷發(fā)生應(yīng)答的細(xì)胞。在短暫性前腦缺血模型中，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)早在20分鐘內(nèi)即發(fā)生。外傷性腦損傷后有IL-6、IL-10、IL-1、IFN-γ等炎性細(xì)胞因子表達(dá)增高，且其血漿含量可作為反映傷情嚴(yán)重程度的可靠指標(biāo)。IL-6在創(chuàng)傷性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用，屬于致傷因子，具有啟動(dòng)和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，與損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞是否在DAI后被激活，是否與促炎因子IL-6一起參與了二次打擊的過程，從

4、而導(dǎo)致其自身及神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用Marmarou A等人于1994年首次報(bào)道的自由落體撞擊方法復(fù)制大鼠DAI模型，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞是否在DAI后被激活，促炎因子IL-6的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討DAI后的神經(jīng)組織中神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，及損傷后炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明DAI的病理生理學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重300克左右，隨機(jī)分為正

5、常對(duì)照組、假手術(shù)組和打擊后不同時(shí)間組(0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d和7d)。正常對(duì)照組大鼠不作處理；假手術(shù)組大鼠給予手術(shù)及打擊前處理，但不予真正的打擊；打擊組大鼠經(jīng)過手術(shù)后，給予打擊，打擊后按不同時(shí)間處死。觀察打擊后大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，麻醉灌注后取全腦，制作石蠟切片，采用HE染色、銀染、焦油紫尼氏小體染色和Weil’s鐵蘇木素髓鞘染色的方法觀察大鼠腦組織的病理改變。將經(jīng)以上方法驗(yàn)證符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠列入打擊組，

6、用免疫組織化學(xué)的方法測定腦組織中各個(gè)腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物CD11b及IL-6在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，P＜0.05為有顯著性差異。結(jié)果：1 組織病理學(xué)變化： HE染色形態(tài)學(xué)變化：正常對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組的大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，均勻致密；打擊組大鼠

7、大腦皮層、腦干等部位可見局灶性點(diǎn)狀出血，大鼠打擊后6h開始出現(xiàn)腦組織充血水腫，24h達(dá)高峰，48h以后腫脹有所減輕。 Bielschowsky's鍍銀染色軸索的形態(tài)學(xué)變化：正常對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元軸突直且長，表面光滑；打擊組大鼠打擊后12h可見胼胝體、腦干和小腦等部位神經(jīng)軸索扭曲、腫脹，呈串珠狀、波浪狀改變，周圍間質(zhì)水腫，上述表現(xiàn)于24h及48h更加明顯，5d明顯好轉(zhuǎn)。 Weil's髓鞘染色髓鞘

8、的形態(tài)學(xué)變化：正常對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，均勻致密，髓鞘橫切面呈環(huán)狀，縱切面呈魚刺狀；打擊組大鼠打擊后6h可見大鼠腦干等部位損傷軸索的周圍髓鞘間隙明顯增寬，髓鞘顯著疏松、水腫及崩解出現(xiàn)空白區(qū)，上述改變?cè)?2h、24h和48h更加明顯，5d明顯好轉(zhuǎn)。 Cresyl violet染色神經(jīng)元尼氏小體的形態(tài)學(xué)變化：正常對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，腦干、皮質(zhì)和小腦等部位神經(jīng)元內(nèi)可見呈藍(lán)紫色，細(xì)小顆粒狀，均勻致密

9、，環(huán)繞在細(xì)胞核的周圍的尼氏小體；打擊組大鼠打擊12h后可見腦干等部位損傷軸索的周圍神經(jīng)元淡染出現(xiàn)空白區(qū)，尼氏小體明顯減少，且呈粗大顆粒狀，上述改變?cè)?4h和48h顯著，5d明顯好轉(zhuǎn)。 2.CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的活化：正常對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組大鼠腦組織CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞淡染，呈棕黃色、分枝狀，胞體小，具有伸向各個(gè)方向的細(xì)小突起；打擊組大鼠打擊后3h可見皮層、小腦、腦干等腦區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b表達(dá)升高，主要

10、分布于損傷軸索及小血管的周圍，且與對(duì)照組有明顯差異(P＜0.05)，其表達(dá)量12h時(shí)增高達(dá)到峰值，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，突起變短、變粗，胞體增大、變圓，CD11b表達(dá)于24h后開始下降，72h后明顯低于12h組，但與對(duì)照組仍然有明顯的差異(P＜0.05)。 3 DAI后IL-6在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)：正常對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組大鼠的腦組織IL-6有表達(dá)，其量很低；打擊組大鼠打擊后6h可見皮層、小腦、腦干等損傷部位腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞有IL-6

11、表達(dá)的升高，與對(duì)照組有明顯差異(P＜0.05)，12h至24h表達(dá)量增高達(dá)到峰值，48h其表達(dá)開始下降，7d時(shí)IL-6的表達(dá)較24h有非常明顯的降低，但較對(duì)照組仍然有明顯的差異(P＜0.05)，陽性細(xì)胞主要是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元也有一定量IL-6的表達(dá)。 結(jié)論：采用Marmarou A的自由落體撞擊方法復(fù)制了大鼠彌漫性軸索損傷模型；DAI后腦組織中CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞活化，12h達(dá)到峰值；DAI后大鼠腦組織中IL-6的表達(dá)升