水通道蛋白5敲除對(duì)呼吸道粘液表達(dá)譜的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分水通道蛋白5在慢性哮喘小鼠模型氣道炎癥和粘液分泌中的作用
　　目的：氣道粘液高分泌是慢性氣道疾病的特征，水通道蛋白5對(duì)于呼吸道液體分泌的量起著很重要的作用，本研究從動(dòng)物水平探討在屋塵螨致敏的慢性哮喘小鼠模型中，水通道蛋白5基因敲除對(duì)氣道炎癥和粘液分泌的影響。
　　方法：應(yīng)用水通道蛋白5基因敲除小鼠和野生型小鼠，屋塵螨滴鼻致敏制備慢性哮喘小鼠模型，HE檢測(cè)病理、炎癥評(píng)分，AB-PAS染色檢測(cè)小鼠氣道杯狀細(xì)胞的增生、免疫

2、組化和Rcaltime-PCR檢測(cè)小鼠氣道粘蛋白NUC5AC、NUC5B的表達(dá)及定量，ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和MUC5AC的表達(dá)。
　　結(jié)果：屋塵螨慢性滴鼻致敏后，和野生型小鼠相比，水通道蛋白5基因敲除鼠病理評(píng)分減輕，BALF中Th2細(xì)胞因子減少，Th1細(xì)胞因子增加，BALF液中MUC5AC蛋白、肺組織中MUC5AC、MUC5B基因和蛋白表達(dá)減少。
　　結(jié)

3、論：水通道蛋白5基因敲除慢性哮喘小鼠過(guò)敏性炎癥和氣道粘液分泌較野生型小鼠減輕。
　　第二部分水通道蛋白5對(duì)PMA誘導(dǎo)的原代小鼠氣道上皮細(xì)胞MUC5AC合成的影響
　　目的：氣道上皮是呼吸道和外環(huán)境相互作用的非特異性屏障，原代培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞保留在體上皮細(xì)胞的特征和功能，是研究呼吸道上皮細(xì)胞很好的模型。本研究從細(xì)胞水平，探討AQP5對(duì)PMA誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)小鼠氣道上皮細(xì)胞MUC5AC合成的影響及可能機(jī)制。
　　方法：原代

4、培養(yǎng)兩種小鼠(水通道蛋白5基因敲除鼠和野生鼠)氣道上皮細(xì)胞，transwell建立氣液平面，2周后掃描電鏡及角蛋白免疫組化鑒定氣道上皮細(xì)胞。PKC特異性激動(dòng)劑PMA刺激原代小鼠氣道上皮細(xì)胞及PKC通路特異性阻斷劑Calphostinc阻斷該通路，ELISA檢測(cè)兩組小鼠MUC5AC蛋白水平的變化，用western blotting檢測(cè)兩組小鼠氣道上皮細(xì)胞PMA刺激后PKC、p-PKC、p-p38、p38、ERK、P-ERK的表達(dá)差異。

5、r>　　結(jié)果：氣液平面培養(yǎng)后，掃描電鏡顯示培養(yǎng)的細(xì)胞上皮有微絨毛和纖毛覆蓋，細(xì)胞角蛋白14免疫組化染色為陽(yáng)性。PMA20ng/ml刺激24小時(shí)后，兩組小鼠氣道上皮細(xì)胞分泌的MUC5AC明顯升高，水通道蛋白5基因敲除鼠增加更顯著，兩者有顯著性差異。PKC特異性阻斷劑Calphostinc能阻斷PMA引起的兩組小鼠MUC5AC分泌。原代小鼠氣道上皮細(xì)胞經(jīng)PMA刺激后，western blotting檢測(cè)顯示PKC、p38磷酸化激活，ERK通

6、路無(wú)變化。
　　結(jié)論：AQP5通過(guò)Ca2+-PKC-p38信號(hào)通路影響粘蛋白MUC5AC的合成和分泌。
　　第三部分 LPS誘導(dǎo)的粘液下腺細(xì)胞MUC5AC和AQP5的變化和調(diào)控機(jī)制
　　目的：氣道粘液分泌物由水和粘蛋白MUC5AC等組成，水/粘蛋白的比例失調(diào)導(dǎo)致痰液粘稠，影響纖毛清除功能。本研究從細(xì)胞水平探討在LPS刺激粘液下腺SPC-A1細(xì)胞后，MUC5AC和AQP5的變化和調(diào)控機(jī)制。
　　方法：用LPS刺激S

7、PC-A1細(xì)胞，Realtime-PCR檢測(cè)AQP5和MUC5AC mRNA水平的變化，western blotting、ELISA法檢測(cè)AQP5和MUC5AC蛋白的變化。用EGFR抑制劑AG1478及MAPKs抑制劑(ERK抑制劑PD98059、p38 MAPK抑制劑ML3404、JNK抑制劑SP600125)干預(yù)，LPS刺激SPC-A1細(xì)胞6小時(shí)后Realtime-PCR檢測(cè)AQP5和MUC5ACmRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：L

8、PS刺激SPC-A1細(xì)胞后，MUC5AC基因和蛋白水平呈時(shí)間、濃度依賴(lài)性升高，同時(shí)AQP5基因和蛋白水平呈時(shí)間、濃度依賴(lài)性降低，兩者呈負(fù)相關(guān)。EGFR抑制劑、p38/JNK抑制劑顯著降低LPS誘導(dǎo)的MUC5ACmRNA的升高，p38/JNK抑制劑減輕AQPSmRNA的降低。
　　結(jié)論：P38/JNK抑制劑為AQP5和MUC5AC共同的信號(hào)通路，應(yīng)用P38/JNK抑制劑能同時(shí)減輕LPS誘導(dǎo)MUC5AC和AQP5的變化，改善水/粘液比