周期性張應(yīng)變對(duì)椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的探討.pdf

1、研究背景 下腰痛是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。雖然引起下腰痛的原因很多，但是椎間盤(pán)退變?nèi)允侵饕蛩?。目前臨床應(yīng)用的治療方法主要解決臨床癥狀，而非針對(duì)退變?cè)缙诘牟±磉^(guò)程，并未延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)退變。關(guān)于椎間盤(pán)退變的原因，雖然做出了許多有益的探討，但其確切發(fā)病機(jī)制仍然不清楚。只有在全面了解椎間盤(pán)退變機(jī)理之后，才可能進(jìn)一步研究阻止其退變甚或使其再生的方法。 目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，椎間盤(pán)退變是一個(gè)由生物化學(xué)和生物

2、力學(xué)因素相互作用的復(fù)雜病理過(guò)程。椎間盤(pán)始終處于負(fù)荷狀態(tài)，尤其是椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞總是受到不同形式的拉伸應(yīng)力作用。纖維環(huán)蛋白多糖含量的下降和/或成分的改變，可以引起纖維環(huán)的退變，進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)椎間盤(pán)退變的發(fā)生。Aggrecan是椎間盤(pán)中蛋白多糖的主要成分。小鼠的Aggrecan基因突變后，可以發(fā)生椎間盤(pán)的退變。同時(shí)椎間盤(pán)蛋白多糖的更新速率較快，對(duì)外界刺激更為敏感。在本實(shí)驗(yàn)中采用周期性張應(yīng)變模擬作用于纖維環(huán)的張應(yīng)力情況，觀察其對(duì)椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞

3、蛋白多糖表達(dá)的影響。 力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及到很多細(xì)胞內(nèi)、外成分。在很多類型的細(xì)胞中，力學(xué)刺激可以使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高和ERK1/2發(fā)生磷酸化，因此，鈣離子和EPK1/2信號(hào)通路被認(rèn)為是細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路。至于纖維環(huán)細(xì)胞是如何將機(jī)械應(yīng)力這一力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化成為細(xì)胞的生物化學(xué)信號(hào)，目前對(duì)其過(guò)程了解甚少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程進(jìn)行探討，旨在揭示機(jī)械應(yīng)力在纖維環(huán)退變中的作用，從生物力學(xué)

4、角度探討椎間盤(pán)退變的發(fā)生機(jī)理。 實(shí)驗(yàn)方法 1.大鼠椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 采用酶消化法分離大鼠椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞，進(jìn)行單層培養(yǎng)，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，通過(guò)甲苯胺藍(lán)、免疫細(xì)胞化學(xué)和堿性磷酸酶染色、透射電鏡觀察等方法對(duì)其表型進(jìn)行鑒定。 2.種植于硅橡膠膜上的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的表型特征研究 利用倒置相差顯微鏡及透射電鏡觀察種植于纖維連接素包被的硅橡膠膜和塑料培養(yǎng)板中的纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化；

5、利用甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖的表達(dá)；通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR法檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ型膠原及Aggrecan的表達(dá)；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞表面整合素β1的表達(dá)；對(duì)不同培養(yǎng)基質(zhì)上的纖維環(huán)細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行分析；同時(shí)檢測(cè)纖維環(huán)細(xì)胞在硅橡膠膜上的貼壁和黏附情況。 3.周期性張應(yīng)變對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)的影響 采用自制周期性張應(yīng)變加載裝置，對(duì)培養(yǎng)椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行不同形式的周期性張應(yīng)變刺激，然后利用RT-PCR檢測(cè)椎間盤(pán)纖維環(huán)中主

6、要蛋白多糖AggrecanmRNA的表達(dá)變化情況。 4.細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路參與周期性張應(yīng)變影響纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)的過(guò)程 1)采用激光掃描共聚焦顯微鏡和Fluo-3/AM熒光探針標(biāo)記技術(shù)，測(cè)定周期性張應(yīng)變對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，并分析了EGTA、維拉帕米和GdCl3處理對(duì)此影響的干預(yù)作用。 2)分別采用EGTA、氯化釓和維拉帕米阻斷細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，然后觀察周期性張應(yīng)變對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)Aggr

7、ecanmRNA的影響情況。 5.MAPK信號(hào)通路在周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)中的作用1)采用Westernblot分析周期性張應(yīng)變處理不同時(shí)間對(duì)椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞MAPK家族中ERK1/2、JNK、p38信號(hào)分子磷酸化水平的影響，并分析相應(yīng)的阻斷劑及siRNA-ERK2對(duì)其磷酸化水平的抑制程度。 2)采用ERK1/2抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125預(yù)處理以及RNA干擾技術(shù)特異性阻斷ERK2后

8、，檢測(cè)周期性張應(yīng)變對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞AggrecanmRNA表達(dá)的影響。 主要結(jié)果 1.大鼠椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 細(xì)胞形態(tài)為圓形或多角形，胞質(zhì)內(nèi)含有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；原代細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，第一代細(xì)胞生長(zhǎng)加快；細(xì)胞具有甲苯胺藍(lán)異染性；有Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)；細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性。 2.種植于硅橡膠膜上的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的表型特征穩(wěn)定 種植于纖維連接素包被的硅橡膠膜和塑料培養(yǎng)板的纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)學(xué)

9、觀察無(wú)明顯差別；在兩種基質(zhì)上的纖維環(huán)細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色無(wú)差異；Ⅰ、Ⅱ型膠原、Aggrecan及整合素β1的表達(dá)亦無(wú)明顯差異；硅橡膠膜培養(yǎng)對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞的細(xì)胞周期無(wú)明顯影響；纖維環(huán)細(xì)胞可以黏附于硅橡膠膜上生長(zhǎng)。 3.周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖的表達(dá) 2％和6％周期性張應(yīng)變對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞AggrecanmRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響；10％周期性張應(yīng)變使AggrecanmRNA的表達(dá)降低，2h降低20％左右，6h降低將近40％；

10、頻率在0.1-2.0Hz的應(yīng)變對(duì)AggrecanmRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響。 4.細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路參與周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)的過(guò)程 1)應(yīng)變?yōu)?0％、頻率為1Hz的周期性張應(yīng)變1min使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加1.13倍；EGTA可以完全阻斷此作用；而維拉帕米和GdCl3僅可部分阻斷。 2)EGTA、氯化釓和維拉帕米均可部分逆轉(zhuǎn)周期性張應(yīng)變對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞AggrecanmRNA表達(dá)的影響，EGTA作

11、用最強(qiáng)，氯化釓次之，維拉帕米作用較弱。 5.MAPK信號(hào)通路參與周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)的過(guò)程 1)周期性張應(yīng)變處理可引起纖維環(huán)細(xì)胞ERK1/2、JNK蛋白磷酸化水平上調(diào)，具有雙向、快速的特點(diǎn)；采用阻斷劑預(yù)處理，使其磷酸化水平降低。周期性張應(yīng)變對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞p38磷酸化水平無(wú)明顯影響。 2)ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125以及RNAi特異性阻斷ERK2均可部分逆轉(zhuǎn)周期性張應(yīng)變下

12、調(diào)AggrecanmRNA表達(dá)的作用。 全文結(jié)論 1.成功培養(yǎng)了大鼠椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞，表型鑒定符合椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞特征，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了前提條件。 2.種植于纖維連接素包被的硅橡膠膜上的纖維環(huán)細(xì)胞表型特征無(wú)改變，為進(jìn)一步研究力學(xué)刺激對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 3.10％周期性張應(yīng)變可以使纖維環(huán)細(xì)胞AggrecanmRNA的表達(dá)降低；周期性張應(yīng)變從轉(zhuǎn)錄水平上影響纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖的產(chǎn)生。 4

13、.周期性張應(yīng)變使纖維環(huán)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，細(xì)胞外鈣內(nèi)流起主要作用，且有不同的鈣離子通道參與；阻斷細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，可以部分抑制周期性張應(yīng)變下調(diào)細(xì)胞AggrecanmRNA表達(dá)的作用。提示細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路可能參與周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)的過(guò)程。 5.周期性張應(yīng)變可以激活椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞MAPK信號(hào)途徑；抑制MAPK信號(hào)通路的活化，可以部分逆轉(zhuǎn)周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細(xì)胞AggrecanmRNA表達(dá)的作用