旋覆花素抑制球囊損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成的機(jī)制研究.pdf

1、目的：經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(petcHtaneoustransluminal coronary angioplasty：，PTCA)是目前治療冠心病的安全、有效方法之一。但其遠(yuǎn)期效果受到局部血管再狹窄(restenosis，RS)的影響。旋覆花素(1-o-acetylbritannilactone，ABL)作為一種具有消炎、鎮(zhèn)痛、活血化瘀功效的天然有效成份，以往體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ABL對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，L

2、PS)誘導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞活化和環(huán)加氧酶-2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)基因的表達(dá)具有顯著抑制作用。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，通過復(fù)制大鼠胸腹主動(dòng)脈球囊損傷模型，探討ABL，抑制球囊損傷大鼠內(nèi)皮增生的機(jī)制，為該藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1、球囊損傷動(dòng)物模型的復(fù)制及分組 將動(dòng)物常規(guī)麻醉消毒，沿頸部正中線切口，于氣管左側(cè)分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈剪一楔形切口，球囊導(dǎo)管自切口插入至胸腹主動(dòng)

3、脈遠(yuǎn)心端，充盈球囊后將其拖回到胸主動(dòng)脈起始部，如此反復(fù)三次：球囊減壓后退出，關(guān)閉切口。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組，分別為正常組、球囊損傷組和ABL組。 2、標(biāo)本的處理 于術(shù)后不同時(shí)間從股動(dòng)脈放血處死大鼠，分離胸腹主動(dòng)脈，分別提取胸腹主動(dòng)脈總蛋白、核蛋白及RNA。分離胸腹主動(dòng)脈中段血管用與病理切片，HE染色觀察ABL對(duì)血管內(nèi)膜增生的抑制作用；通過電泳遷移率改變分析(electrophoretic mobility shift ass

4、ay，EMSA)觀察ABI囊損傷誘導(dǎo)的核因子kB (NF-kB)p65與DNA順式元件相互作用的影響；Western blot分析檢測(cè)NF-kB p65的表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位以及炎性基因COX-2和iNOS的表達(dá)變化；RT-PCR檢測(cè)炎性基因ICAM-1轉(zhuǎn)錄情況的影響； 結(jié)果： 1、ABL抑制球囊損傷后血管內(nèi)膜的增生 球囊損傷術(shù)后14天，ABL，組血管內(nèi)膜的增生程度明顯小于球囊損傷組，兩組的血管內(nèi)膜/中膜(int

5、ima/media，I/M)厚度比分別為0.45±0.03和1.87±0.16，兩組之間比較具有顯著性差異(P<0.01)。表明ABL可以明顯抑制球囊損傷后血管內(nèi)膜的增生。 2、ABL抑制球囊損傷誘導(dǎo)的NF-kB p65的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位 Westem blot結(jié)果顯示：在正常血管中NF-kB p65少量表達(dá)。球囊損傷后，血管總蛋白中p65的水平呈進(jìn)行性升高，于術(shù)后14天含量達(dá)到峰值。ABL可抑制球囊損傷誘導(dǎo)的NF-kB p

6、65表達(dá)。而且，ABL對(duì)p65從胞漿至胞核的轉(zhuǎn)位過程也具有明顯的抑制作用。 3、ABL 抑制球囊損傷后血管壁中IkB的磷酸化降解 Westem blot分析結(jié)果顯示，正常血管細(xì)胞的胞漿中含有較高水平的IkB-α。球囊損傷14天時(shí)，IkB-α水平明顯降低，約為正常組的46.7％，而磷酸化的IkB一α則較正常組升高。ABL對(duì)IkB的磷酸化具有較強(qiáng)的抑制作用，使磷 酸化的IkB-α水平較球囊損傷組降低了89.2％±7.

7、4％，具有顯著性差異(P<0.01)。提示.ABL具有抑制IkB磷酸化降解提高其穩(wěn)定性的作用。 4、ABL 抑制球囊損傷后NF-kB p65與DNA順式元件的相互作用 以5′末端標(biāo)記的含有NF-kB結(jié)合基序的雙股寡核苷酸為探針，分別與三組血管組織核蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。經(jīng)電泳分離后，放射自顯影可見，球囊損傷組的核蛋白與探針的結(jié)合活性顯著增加，在5％PAGE上出現(xiàn)滯后的DNA.蛋白質(zhì)復(fù)合物區(qū)帶，ABL則對(duì)NF-kB與DNA

8、的結(jié)合活性有明顯的抑制作用。 5 ABL抑制球囊損傷的炎性基因COX-2、iNOS和ICAM-1的表達(dá) Western blot分析檢測(cè)了NF-kB下游炎性基因COX-2和iNOS的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示：球囊損傷14天時(shí)，血管組織中COX-2和iNOS蛋白水平較正常組顯著升高；給予ABL后，兩種蛋白的水平明顯降低，與球囊損傷組相比分別降低了65.7％±7.9％和47.2％±5.4％，具有顯著性差異(P<0.01，P<0

9、.01)。RT-PCR結(jié)果顯示：球囊損傷3天后血管組織中ICAM-1 mRNA表達(dá)活性顯著增高，ABL組對(duì)ICAM-1 mRNA的表達(dá)具有明顯抑制作用，與球囊損傷組相比降低了56.3％±7.3％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 6、ABL對(duì)COX-2催化活性的影響 為了觀察球囊損傷以及ABL對(duì)COX-2活性的影響，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGE<,2>水平。結(jié)果顯示，正常組、 球囊損傷組、ABL組血清

10、的PGE<,2>含量分別為：1300±129pg/ml，2600±195 pg/ml和945±136 pg/ml。與球囊損傷組相比，ABL組能夠明顯抑制PGE2的合成(P<0.01)。 7 ABL長(zhǎng)效抑制球囊損傷后血管組織中IKKp的磷酸化降解進(jìn)一步研究表明，球囊損傷后14天時(shí)，血管組織中IKKβ和p-IKKβ的表達(dá)均有所升高，ABL則對(duì)血管組織中IKKβ和p-IKKβ水平具有明顯的抑制作用，分別較球囊損傷組降低了46.9％±6