旋覆花素對(duì)阿爾茨海默病的干預(yù)及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(AD)是一種常見的老年神經(jīng)變性疾病，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和精神異常。 單味中藥的某一類化學(xué)成分藥理作用明確，療效穩(wěn)定，毒副作用小，符合當(dāng)前的醫(yī)療市場要求，對(duì)防治老年癡呆有著良好的市場前景。歐亞旋覆花(Inula Britannica，)是一種傳統(tǒng)的中草藥，其化學(xué)成分有40多種，旋覆花內(nèi)酯(ABL)是從歐亞旋覆花的氯仿提取物中分離出的有效單體成分，體外證實(shí)旋覆花內(nèi)酯通過抑制NF-k B的激活而消除LPS誘導(dǎo)

2、的炎癥相關(guān)基因如環(huán)加氧酶(COX-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達(dá)而發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞活化和抗炎作用?；贏D是一種慢性炎癥性疾病，旋覆花素是旋覆花單體有效成分的特定組合，本研究通過觀察旋覆花素對(duì)A β誘導(dǎo)的AD模型大鼠的干預(yù)效應(yīng)，探討其作用機(jī)制，旨在確定該有效部位的藥用價(jià)值和作用途徑。 1.旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織COX-2，iNOS基因表達(dá)的影響 腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)是AD的重要病理特征，多種炎癥因子能

3、促進(jìn)COX-2和iNOS的表達(dá)，COX-2和iNOS及其催化產(chǎn)物又可促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展，直接或間接引起神經(jīng)元的死亡。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)及Western blot方法，分別觀察旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織炎性基因COX-2，iNOS表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.1旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織COX-2基因表達(dá)的影響 作為炎癥相關(guān)基因，COX-2廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)觀察了旋覆花素對(duì)COX-2表達(dá)的影

4、響。對(duì)照組海馬組織COX-2陽性染色細(xì)胞數(shù)量少，且?guī)缀醪恢荒Ｐ徒M海馬組織COX-2陽性染色細(xì)胞數(shù)量多，著色深；旋覆花素給藥組大鼠COX-2陽性染色細(xì)胞數(shù)量較模型組減少，著色較淺，但仍比對(duì)照組數(shù)量多，著色深。Western blot顯示，對(duì)照組海馬組織COX-2表達(dá)量低，模型組海馬組織表達(dá)量顯著增高，給予旋覆花素治療后，大鼠腦海馬組織COX-2表達(dá)量明顯下降。以上結(jié)果提示旋覆花素可以抑制A β誘導(dǎo)的.AD模型大鼠腦海馬組織的COX-2

5、基因的表達(dá)。 1.2旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織iNOS基因表達(dá)的影響 激活的小膠質(zhì)細(xì)胞活化iNOS產(chǎn)生大量具有神經(jīng)毒性的NO，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。本實(shí)驗(yàn)觀察了旋覆花素對(duì)iNOS表達(dá)的影響。對(duì)照組海馬組織iNOS陽性染色細(xì)胞數(shù)量少，且?guī)缀醪恢?；模型組海馬組織iNOS陽性染色細(xì)胞數(shù)量多，著色深；旋覆花素給藥組大鼠iNOS陽性染色細(xì)胞數(shù)量較模型組減少，著色較淺，但仍比對(duì)照組數(shù)量多，著色深。Western blot顯示，對(duì)照

6、組海馬組織iNOS表達(dá)量低，模型組海馬組織表達(dá)量顯著增高，給予旋覆花素治療后，大鼠腦海馬組織iNOS表達(dá)量明顯下降。以上結(jié)果提示旋覆花素可以抑制A β誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬組織iNOS基因的表達(dá)。 1.3海馬組織形態(tài)學(xué)改變 形態(tài)學(xué)分析可見，正常大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目多，呈多層，排列整齊緊密。核呈圓形，大而清晰，核仁明顯。神經(jīng)纖維密集，排列整齊。模型組呈現(xiàn)典型的AD病變，可見海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯減少，脫失現(xiàn)象明顯，層次少而

7、不清，排列紊亂。核固縮為三角形或多角形，濃染。神經(jīng)纖維稀疏，排列紊亂，間隙擴(kuò)大，神經(jīng)元周圍有大量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，表明本研究建立的模型是成功的。而旋覆花素給藥組大鼠上述神經(jīng)元損傷明顯減輕，海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯增加，排列較整齊，核固縮現(xiàn)象明顯改善，核仁較明顯。神經(jīng)纖維數(shù)目也明顯增加，排列較整齊。 1.4旋覆花素對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響 采用Morris水迷宮進(jìn)行測試，結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練時(shí)段的增加，所有動(dòng)物尋找站臺(tái)的潛伏期越來

8、越短，表明三組大鼠通過學(xué)習(xí)，均可對(duì)水下的站臺(tái)產(chǎn)生空間定位記憶。訓(xùn)練第1天，模型組大鼠和旋覆花素給藥組大鼠差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，對(duì)照組大鼠與模型組大鼠、旋覆花素給藥組大鼠比較平均潛伏期延長，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明模型組大鼠和旋覆花素給藥組大鼠確有空間學(xué)習(xí)記憶能力的障礙；訓(xùn)練第2、3、4天，模型組大鼠平均潛伏期明顯延長，與對(duì)照組大鼠、旋覆花素給藥組大鼠比較差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而旋覆花素給藥組大

9、鼠與對(duì)照組大鼠比較，兩者之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示旋覆花素可以改善A β誘導(dǎo)的AD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙；訓(xùn)練第5天，三組大鼠達(dá)穩(wěn)定水平，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在空間搜索中實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠最后一次跨平臺(tái)次數(shù) (7.6±1.78)，較對(duì)照組大鼠(12.4±2.73)及旋覆花素給藥組大鼠(9.8±2.23)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)提示本實(shí)驗(yàn)造模是成功的，旋覆花素可有效改善AD

10、模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)。 2.旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織NF-κB、PPAR γ基因表達(dá)的影響 NF-κB是一種多向性轉(zhuǎn)錄因子，它的結(jié)合序列存在于多種促炎和促增殖基因的調(diào)控區(qū)中，通過激活靶基因表達(dá)，在免疫、炎癥、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖分化與凋亡等方面發(fā)揮重要的作用。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族。PPARs的活性降低與炎癥介質(zhì)的水平上升密切相關(guān)。近來研究認(rèn)為PPAR

11、s在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要作用，尤其PPAR γ在腦內(nèi)的表達(dá)與炎癥和神經(jīng)退行性變緊密聯(lián)系。為了進(jìn)一步探討旋覆花素抑制AD模型大鼠海馬炎癥反應(yīng)、改善記憶功能的機(jī)制，在本部分實(shí)驗(yàn)中，采用免疫組織化學(xué)及Western blot方法進(jìn)一步研究旋覆花素對(duì)NF-κB、PPAR γ激活的影響，以揭示旋覆花素抑制iNOS、COX-2表達(dá)的分子機(jī)制，為探明旋覆花素抑制AD腦炎癥反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。其結(jié)果如下： 2.1旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織

12、NF-k B基因表達(dá)的影響 NF-k B是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。為了探討NF-k B在旋覆花素抑制A β誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬炎癥中的作用，本實(shí)驗(yàn)檢測了NF-k B在大鼠腦海馬組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組海馬組織p50陽性染色細(xì)胞數(shù)量少，著色淺；模型組海馬可見大量p50陽性染色細(xì)胞，染色細(xì)胞數(shù)量多，著色深；旋覆花素給藥組海馬組織p50陽性染色細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著減少，著色淺。Western blot分析顯示，在對(duì)照組

13、細(xì)胞中p50主要分布于細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中僅有少量的p50存在；Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬組織細(xì)胞核內(nèi)p50水平明顯升高；服用旋覆花素的給藥組大鼠腦海馬組織細(xì)胞核中p50的表達(dá)量與模型組相比顯著減少。三組海馬組織細(xì)胞漿中p50的含量無明顯差異。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，旋覆花素具有抑制A β誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬組織p50表達(dá)與核轉(zhuǎn)位的效應(yīng)。 2.2旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織PPAR γ基因表達(dá)的影響 PPAR γ

14、可抑制NF-k B基因的表達(dá)，與腦內(nèi)炎癥反應(yīng)及A β沉積密切相關(guān)。為了探討旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織PPAR γ表達(dá)的影響，我們檢測了PPAR γ在海馬內(nèi)的表達(dá)。Western blot顯示，對(duì)照組海馬組織表達(dá)量高，模型組海馬組織表達(dá)量顯著降低，給予旋覆花素治療后，大鼠腦海馬組織PPAR γ表達(dá)量明顯上調(diào)。提示旋覆花素具有促進(jìn)A β誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬組織的PPAR γ表達(dá)的作用。 3.旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬神經(jīng)

15、細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡是貫穿于機(jī)體生命過程始終，普遍存在的一種由基因活動(dòng)指導(dǎo)下的細(xì)胞主動(dòng)性死亡現(xiàn)象。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD等退行性疾病發(fā)展過程中的重要事件，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞是不可逆的，但處于凋亡過程中的神經(jīng)細(xì)胞存在不同程度的可逆性。本部分實(shí)驗(yàn)觀察了旋覆花素對(duì)A β海馬內(nèi)注射誘導(dǎo)AD模型大鼠腦海馬組織凋亡相關(guān)基因變化的影響，以期從凋亡角度闡明旋覆花素對(duì)AD的防治作用及其機(jī)制。 結(jié)論: 1.旋覆花素顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的AD

16、模型大鼠腦海馬組織炎癥基因iNOS、COX-2表達(dá)，抑制海馬炎癥反應(yīng)。 2.旋覆花素通過抗炎作用而改善Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。 3.旋覆花素顯著抑制AD模型大鼠腦海馬組織的NF-κB基因表達(dá)，而增強(qiáng)PPARγ基因表達(dá)，從而抑制炎癥基因的表達(dá)。 4.旋覆花素主要通過抑制促凋亡基因Bax以及Caspase-3的表達(dá)，抑制Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，而對(duì)凋亡抑制