脂質(zhì)納米載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)運與抗腫瘤藥效研究.pdf

1、固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是繼乳劑、脂質(zhì)體、微粒和毫微粒后近年來研究十分活躍的靶向控釋膠粒給藥系統(tǒng)。sLN在室溫下通常呈現(xiàn)固態(tài)，具有聚合物納米粒物理穩(wěn)定性高、藥物泄漏少的優(yōu)勢，又兼有脂質(zhì)體、乳劑的毒性低優(yōu)點，是一種潛在的新型給藥系統(tǒng)。作為一種新型給藥系統(tǒng)，SLN具有廣闊的發(fā)展前景，但是，sLN也存在一些潛在的局限性，如有限的載藥能力、儲存過程的藥物排擠現(xiàn)象等問題。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nan

2、ostructured lipidCarrier．NLC是新一代的脂質(zhì)納米粒。NLC由幾種熔點不同的固液脂質(zhì)混合物作為基質(zhì)。液體脂質(zhì)的加入，可擾亂固體脂質(zhì)規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，增加納米粒結(jié)構(gòu)中不規(guī)則晶型的比例，使承載脂溶性藥物的空間容量增加，從而提高載體的載藥能力。通過控制液體脂質(zhì)比例，還可使NLc在體溫下保持固體骨架結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)NLC藥物的控制釋放。 本研究以異硫氰基熒光素的異硫氰基與硬脂胺的氨基的偶合反應(yīng)制備得到的硬脂胺-異硫氰基熒

3、光素(octadecylamine-fluorescein isothiocyanate，ODA-FITC)為熒光標(biāo)記物，通過溶劑擴散法制備熒光標(biāo)記脂質(zhì)納米載體。以A549肺癌細(xì)胞為模型細(xì)胞，考察不同脂質(zhì)納米載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)運。研究表明，A549細(xì)胞攝取不同脂質(zhì)材料固體脂質(zhì)納米粒的能力高低順序為三硬脂酸甘油酯(三甘酯)sLN>單硬脂酸甘油酯(單甘酯)sLN>硬脂酸SLN>山崳酸甘油酯sLN。在此基礎(chǔ)上，本研究以抗腫瘤藥物紫杉醇為藥物模型，制

4、備負(fù)載紫杉醇的固體脂質(zhì)納米粒，考察納米粒的粒徑、電位、藥物包封率、載藥量、細(xì)胞轉(zhuǎn)運能力與紫杉醇固體脂質(zhì)納米粒的細(xì)胞毒性的相互關(guān)系。研究表明，與游離藥物溶液(溶劑為Cremophor：無水乙醇=1：l(V/V))相比，紫杉醇經(jīng)固體脂質(zhì)納米粒包封后，藥物的細(xì)胞毒性顯著增強，其中以單甘酯sLN的細(xì)胞藥效最佳；以具有快速細(xì)胞轉(zhuǎn)運能力的三甘酯為基本材料制備的紫杉醇SLN，由于其較低的載藥量和包封率，并未顯示出較高的細(xì)胞毒性。經(jīng)聚乙二醇單硬脂酸酯(

5、polyethylene glycol monostearate，PEG-SA，乙二醇聚合度為40)修飾后的單甘酯SLN，細(xì)胞攝取增加，但其在細(xì)胞水平的藥效未見增加。納米粒的細(xì)胞攝取可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞來進(jìn)一步優(yōu)化。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體數(shù)目和活性明顯高于正常細(xì)胞，因此用傳統(tǒng)方法難以治療的惡性腫瘤可以通過葉酸受體的介導(dǎo)進(jìn)行靶向治療。本研究進(jìn)一步合成了葉酸．硬脂酸嫁接物(folic acid-stearic acid，F(xiàn)A-SA)，

6、通過溶劑擴散法制備葉酸修飾單甘酯固體脂質(zhì)納米粒。利用葉酸受體在多種腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)的特點，以期實現(xiàn)固體脂質(zhì)納米粒的高效腫瘤細(xì)胞攝取。研究表明，經(jīng)FA-SA修飾后，單甘酯固體脂質(zhì)納米粒的細(xì)胞攝取與其給藥系統(tǒng)在細(xì)胞水平的藥效均有所增加。 以單甘酯為固體脂質(zhì)材料，油酸為液體脂質(zhì)材料，溶劑擴散法制備納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers，NLC)。以A549細(xì)胞為模型細(xì)胞，用ODA-FITC標(biāo)記

7、含不同比例液體脂質(zhì)的NLC，熒光倒置顯微鏡觀察并比較細(xì)胞對含不同比例液體脂質(zhì)的NLC的攝取能力，并測定熒光強度。研究表明，NLC的細(xì)胞攝取隨著脂質(zhì)材料中油酸比例的增加而增加。以紫杉醇為模型藥物，制備載藥NLC。隨著油酸含量的增加，NLC的藥物包封率、載藥量、藥物釋放速率隨之增加。體外細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示：空白NLC為低細(xì)胞毒性載體；與游離藥物相比，載紫杉醇的NLC的細(xì)胞毒性顯著增強，且隨著油酸比例的增加而增加。本研究合成了FA-SA用于

8、修飾NLC來實現(xiàn)葉酸受體介導(dǎo)的納米粒細(xì)胞攝取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與游離藥物相比，葉酸修飾NLc在細(xì)胞水平的藥效提高了86倍。 多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是當(dāng)前臨床上惡性腫瘤化療失敗的主要因素之一。在目前所發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR的機制中，最普遍也是研究最廣泛的是P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)的作用，P-gp以ATP能量依賴的方式主動地將藥物(主要是疏水性藥物，如紫杉醇、阿霉素等)從

9、細(xì)胞內(nèi)“泵出”到細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，導(dǎo)致細(xì)胞毒作用減弱或喪失，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。有研究表明，納米粒給藥系統(tǒng)可以保護包封藥物進(jìn)入細(xì)胞,避免P-gP藥泵的作用，從而克服耐藥性。本研究進(jìn)一步考察了脂質(zhì)納米載體的逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥作用。以乳腺癌細(xì)胞MCF-7敏感株、MCF-7耐藥株(MCF-7/ADR)為模型細(xì)胞，用四唑鹽比色法(MTF Assay)法分別評價載紫杉醇或阿霉素SLN和NLC在敏感和耐藥株上的毒性，考察SLN和NLC給藥

10、系統(tǒng)的藥效和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥細(xì)胞的耐藥性能力。 與游離藥物溶液比較，sLN和NlJc包封紫杉醇和阿霉素后，有效地增強了它們對MCF-7和MCF-7/ADR的細(xì)胞毒性，紫杉醇SLN和阿霉素sLN對MCF-7耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為31.0和4.3，紫杉醇NLC和阿霉素NLC對MCF-7耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為34.3和6.4。經(jīng)FA-SA修飾后，葉酸修飾紫杉醇NLc和阿霉素NLC對MCF-7/ADR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別增加至52.2和8.3