可控酶解蠶蛹蛋白制備血管緊張素轉換酶抑制肽及其構效關系的研究.pdf

1、高血壓是最常見的心血管疾病之一，它能造成大腦、心血管、腎臟的損害，是導致腦卒中、心力衰竭和冠心病等疾病的重要因素。天然食品中的降血壓功能因子由于無副作用，已成為非藥物控制高血壓進程的理想選擇。利用生物酶水解食物蛋白所生成的肽類能夠表現(xiàn)出不同的生物活性，這些生物活性肽在消化降解和食物加工制作過程中可從其前體蛋白中釋放出來。
　　 蠶蛹蛋白是一種高營養(yǎng)蛋白，我國每年的蠶蛹產量非常高，但是至今蠶蛹蛋白的綜合利用途徑還不完善，形成的產品

2、附加值也不高。本研究通過可控酶解的辦法，對利用蠶蛹蛋白制備具有降血壓效果的血管緊張素轉換酶抑制肽進行了系統(tǒng)研究。
　　 本文首先建立起了一種快速方便檢測血管緊張素轉換酶抑制肽活性的RP—HPLC方法，并優(yōu)化了底物HHL與ACE酶作用轉化為馬尿酸(HA)的最佳反應當量，得出了HHL和ACE之間最優(yōu)的定量關系是：HHL為5mM濃度時體積為6μL，ACE為0.1U/ml濃度下10μL。通過對蠶蛹蛋白酶解產物活性的測定，證明該方法具有快

3、速、方便、準確的特點。
　　 通過利用不同蛋白酶對蠶蛹蛋白進行水解，得出酸性蛋白酶(Aspergillus usamii N0．537)水解的產物具有ACE抑制活性高、苦味低、色澤好、溶液穩(wěn)定性好的特點，確定利用酸性蛋白酶作為水解蠶蛹蛋白的首選酶。通過單因子實驗、部分因子優(yōu)化和中心點組合設計實驗，得出了酸性蛋白酶水解蠶蛹蛋白的最優(yōu)的水解條件為水解溫度35℃，水解時間4.92 h，酶比底物(w/w)為1％(相當于500U/g底物)

4、，底物濃度(水/蠶蛹蛋白)為14.94(w/v)，pH為2.18，使水解產物的ACE抑制活性IC50從單因子實驗結果的2.5mg/mL增強到1.38mg/mL。
　　 利用傳統(tǒng)的Osborne蛋白提取方法，根據(jù)每種蛋白組分的溶解特性的區(qū)別，提取到了四種蛋白組分，在蠶蛹蛋白中，蛋白組分的含量特點為清蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白。清蛋白組分為蠶蛹粉中的優(yōu)勢蛋白組分。對四種蛋白組分的氨基酸組成分析表明，清蛋白的必需氨基酸占總氨基酸的

5、44.58％，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為80.43％，比WHO/FAO提出的必需氨基酸占總氨基酸的40％，和必需氨基酸與非必需氨基酸之比為60％的參考蛋白模式要高。
　　 通過中心點實驗優(yōu)化方法得出了清蛋白的最佳提取條件為：水/蛋白原料在6.8，提取時間5h，使清蛋白的純蛋白得率從17.39g/100g蛋白原料上升到26.41g/100g蛋白原料，提高了34％。總蛋白得率達到61.83％。
　　 了解潛在的具有抗高

6、血壓活性蛋白原料的具體組成成分，以及明確哪種蛋白組分對ACE抑制活性起主要貢獻作用，對更好的開發(fā)該蛋白原料具有重要意義。通過對蠶蛹蛋白組分的分子量分布特點和其水解產物的分子量分布情況與其ACE抑制活性之間的關系進行研究，得出蠶蛹蛋白組分中，清蛋白組分的ACE抑制率最高，水解度也最高，表明清蛋白易于被酸性蛋白酶水解，所得小肽分子生物活性強。
　　 對清蛋白組分經酸性蛋白酶酶解后的產物，經過超濾、凝膠過濾、多維液相系統(tǒng)和離子阱質譜的

7、逐步分離和檢測，得出一個新的ACE抑制肽，其結構為“SEPTVF”，通過化學同相合成法合成六肽SEPTVF，檢測ACE抑制活性，得出此活性肽ACE抑制活性的IC50值為324μM。
　　 以20個已經公布了結構和活性數(shù)據(jù)的ACE抑制肽作為訓練集，生成了ACE抑制肽的藥效團模型(Hypo1)。將從蠶蛹蛋白中得到的血管緊張素轉化酶抑制肽(set—glu—pro—thr—val—phe)與該選擇的藥效團模型Hypo1進行疊合比較，識別

8、其對ACE抑制活性起關鍵作用的結構部分，證明此活性肽的thr—val—phe部分對其ACE的抑制活性起主要作用。
　　 通過研究自發(fā)性高血壓大鼠血壓(spontaneously hypertensive rat，SHR)攝入清蛋白酶解產物前后動脈收縮壓的變化，得出清蛋白酶解產物對自發(fā)性高血壓大鼠具有短期和長期降低動脈收縮壓的效果。
　　 本論文的研究結果為綜合利用蠶蛹蛋白，利用蠶蛹蛋白制備具有高經濟附加值的降血壓活性肽制