可控酶解水蛭制備抗凝血肽的研究.pdf

1、水蛭作為一味傳統(tǒng)活血化瘀中藥，具有破血、逐瘀、通經(jīng)之功能，隨著近年來對活血化瘀治療各種疑難病研究的不斷深入，水蛭的藥用也倍受青睞。在中醫(yī)臨床上用單味水蛭或配伍復(fù)方，使用煎劑、散劑、膠囊劑和口服液等劑型，內(nèi)服給藥，治療心腦血管疾病療效顯著。但是這類水蛭制劑由于具有水蛭藥材的腥臭味，不良反應(yīng)較多，同時由于成分復(fù)雜，不易控制藥材質(zhì)量，采用傳統(tǒng)的提取、濃縮工藝方法，使有些成分分解、破壞，或提取不出來，易使有效成分損失，藥效波動大，亟待研發(fā)新的水

2、蛭制劑以滿足臨床需求。本研究在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，采用可控酶解、超濾、瓊脂糖離子交換層析等生物制藥技術(shù)對樣品進(jìn)行純化，從而得到純度高、生物活性強的低分子量水蛭抗凝血肽（HAP），并對其抗腦缺血活性進(jìn)行了研究，主要研究內(nèi)容如下： ⑴水蛭可控酶解工藝研究。以抗凝血活性為主要指標(biāo)，研究了影響酶解方法的主要因素：蛋白酶種類、酶用量、底物濃度、酶解液pH值、酶解溫度及酶解時間。通過試驗，確定了最優(yōu)的酶解條件：采用胰蛋白酶，酶用量5000N

3、FU·g—1，底物濃度10％，調(diào)節(jié)pH8．5，控制酶解溫度50℃，酶解時間8h。 ⑵HAP分離純化及性質(zhì)研究。以抗凝血活性為主要指標(biāo)，分別比較了不同濃度的有機溶劑、不同分子截留量的超濾膜、不同色譜條件對產(chǎn)物活性的影響，確定了HAP的分離純化條件：酶解液加2倍量的丙酮沉淀，上清夜回收丙酮后加水稀釋，0．22μm微孔濾膜濾過后經(jīng)5kD的超濾膜超濾，收集超濾液，濃縮，通過經(jīng)二乙醇胺．鹽酸（pH9．0）平衡的Q—Sephrose FF色

4、譜柱，先用兩倍量的上樣緩沖液洗去未結(jié)合部分，再以1mol·L—1NaCl溶液洗脫，收集洗脫液，G10脫鹽，濃縮，冷凍干燥，得HAP；測得肽含量為53．3％，采用紫外光譜法、紅外光譜法、質(zhì)譜法研究產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特點。 ⑶HAP活性研究。采用MCAO模型大鼠，觀察到HAP組16mg·kg—1、8mg·kg—1組可明顯改善大鼠神經(jīng)癥狀，降低腦梗塞范圍，與模型組相比具有顯著差異；HAP組16mg·kg—1、8mg·kg—1可明顯升高缺血再灌注

5、大腦的SOD、GSH、GSH—PX含量，降低MDA、LDH、NO含量，HAP16 mg·kg—1組可明顯升高缺血再灌側(cè)大腦的Na+—K+—ATPase和Ca2+—Mg2+—ATPase的活性。采用小鼠冷水負(fù)重游泳后斷頭全腦缺血模型，觀察到HAP20mg·kg—1、10mg·kg—1、5mg·kg—1可明顯增加小鼠斷頭呼吸時間。采用體外法，觀察到HAP具有一定的溶栓作用；采用動—靜脈旁路血栓形成方法，觀察到HAP16mg·kg—1、8mg

6、·kg—1、4mg·kg—1可不同程度減少動靜脈環(huán)路血栓的濕重。采用體外法，觀察到HAP可以延長健康人血漿APTT及PT，并能抑制ADP誘導(dǎo)的健康人血小板聚集。 ⑷本課題取得的主要成果：成功的采用可控酶解法制得HAP，所得產(chǎn)物肽含量達(dá)53．3％，符合《藥品注冊管理辦法》中中藥、天然藥物注冊分類5的技術(shù)要求；采用多個動物模型，對HAP的多方面的藥效學(xué)試驗進(jìn)行研究，證實了HAP對缺血性中風(fēng)有著很好的療效，為水蛭抗凝血肽的開發(fā)打下堅實