cFLIP在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達及其在Luteolin誘導Hep-2細胞凋亡中的作用.pdf

1、第一部分：cFLIP在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達以及其臨床意義 目的：Fas(Apo-1，CD95)信號通路在誘導腫瘤細胞凋亡、維持機體免疫監(jiān)視功能中發(fā)揮著重要作用。雖然頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squanlous cellcarcinoma，HNSCC)細胞均不同程度地表達Fas蛋白，但是，體內(nèi)、外實驗證實頭頸部鱗狀細胞癌細胞對Fas受體介導的細胞凋亡并不敏感，這意味著在頭頸部鱗狀細胞癌細胞中可能存在著可以抑

2、制Fas受體介導的細胞凋亡的因子。cFLIP(細胞型FLICE樣抑制蛋白cellular FLICE-like inhibitory protein，cFLIP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型凋亡調(diào)控蛋白，它可以抑制Fas及其它死亡受體介導的細胞凋亡，并且其表達水平與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性。而關(guān)于cFLIP在頭頸部鱗狀細胞癌中表達的研究尚未見報道。因此，本實驗的目的旨于明確cFLIP在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達情況，并探討其表達與腫

3、瘤臨床病理參數(shù)、Fas蛋白表達情況的相關(guān)性。 方法：運用免疫組織化學染色方法檢測了58例頭頸部鱗狀細胞癌組織及30例形態(tài)學正常的、腫瘤周圍粘膜組織中cFLIP、Fas蛋白表達情況；運用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)技術(shù)檢測了30例癌組織及正常粘膜組織中cFLIP兩種蛋白亞型的mRNA表達水平；另外，應用Western blot方法進一步明確了cFLIP兩種蛋白亞型在頭頸部鱗狀細胞癌組織及正常粘膜組織中的表達情況。

4、結(jié)果：1.cFLIP在頭頸部鱗狀細胞癌組織中的表達明顯高于在正常粘膜：腫瘤組織中的陽性表達率為94.8％(55/58)，然而僅有15.0％(3/20)的正常粘膜呈現(xiàn)出輕微的cFLIP陽性反應，并且兩者染色積分間的差異具有顯著性(P＜0.01)。 2.雖然在mRNA水平，cFLIP的兩種蛋白亞型：cFLIPL mRNA、cFLIPsmRNA在頭頸部鱗狀細胞癌組織中均有表達，并且兩者的表達水平均高于其在正常粘膜中的表達(P＜0.01

5、)，但是利用Western blot方法僅檢測到cFLIPL蛋白的表達。 3.由于cFLIPLmRNA和cFLIP蛋白表達水平之間存在明顯的相關(guān)性、Western blot方法僅檢測到eFLIPL蛋白的表達，因此，可以認為cFLIPL是cFLIP蛋白在頭頸部鱗狀細胞癌中的主要表達亞型。 4.cFLIP蛋白的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位和組織學分級之間無相關(guān)性，但是與腫瘤TNM分期(P＜0.01)以及有無淋巴結(jié)

6、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.01)。 5.雖然，所有的正常粘膜組織和89.7％(52/58)腫瘤組織均不同程度的表達Fas蛋白，但是，F(xiàn)as蛋白染色積分在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義。并且，F(xiàn)as蛋白在腫瘤組織中的表達與患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、組織學分級、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理學參數(shù)均無相關(guān)性。雖然，所有Fas蛋白陽性表達的腫瘤組織均不同程度的表達cFLIP蛋白，但是，兩者的染色積分無任何相關(guān)性(P＞0.05)。

7、 結(jié)論：cFLIPL，蛋白高表達在頭頸部鱗狀細胞癌中是常見現(xiàn)象，并且cFLIPL蛋白的表達情況與腫瘤。TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由此可見，高表達的cFLIPL蛋白可以通過抑制Fas或其它的死亡受體介導的細胞凋亡從而在頭頸部鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。 第二部分：Luteolin誘導Hep-2細胞凋亡的途徑以及cFLIP的作用 目的：木犀草素(Luteolin)是一種很具有代表性的天然黃酮

8、化合物，具有多種生物學功能。近年來，其抗癌活性引起人們的關(guān)注。Luteolin可以抑制多種腫瘤細胞的增殖或誘導細胞凋亡，但是，關(guān)于其對頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)細胞的作用尚未見報道，并且其抗癌機制也有待于進一步研究。雖然有研究表明Luteolin可以通過增加Caspase-8的活性、上調(diào)死亡受體表達而誘導細胞凋亡，但是，未見有關(guān)死亡受體信號通路阻斷劑cFLI

9、P在Luteolin誘導細胞凋亡中作用的研究報道。本課題第一部分的實驗結(jié)果表明cFLIPL在頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，并且與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。并且，有研究表明：可能正是由于缺少了Caspase-8的活化而造成Hep-2細胞系對順鉑等化療藥物的不敏感。因此，我們擬研究Luteolin是否可以抑制頭頸部鱗狀細胞癌細胞系--Hep-2細胞的增殖活性、誘導細胞凋亡及可能途徑以及cFLIP的作用。 方法：

10、Luteolin作用于Hep-2細胞不同時間階段后用MTT法測定Luteolin對Hep-2細胞增殖活性的抑制作用；利用流式細胞儀檢測Luteolin對Hep-2細胞的細胞周期的影響；以形態(tài)學、細胞凋亡標記物檢測確定Luteolin是否可以誘導Hep-2細胞凋亡；利用流式細胞儀檢測Caspase家族活性變化；利用Western blot方法從蛋白水平研究Luteolin對Hep-2細胞cFLIP、Fas表達的影響；應用RT-PCR技術(shù)從

11、分子水平探討Luteolin對Hep-2細胞cFLIP、Fas蛋白表達影響的機制，并探討cFLIP在Luteolin誘導細胞凋亡中的可能作用。 結(jié)果：1.Luteolin能有效抑制體外培養(yǎng)的Hep-2細胞的增殖活性，并且具有濃度和時間依賴性，藥物作用24h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為52.69μmol/L。 2.Luteolin不僅可以誘導Hep-2細胞發(fā)生細胞周期阻滯，細胞主要被阻滯于G1期；并且，這種細胞周期阻滯效應

12、存在劑量依賴性。 3.Annexin-V/PI雙染法的結(jié)果表明Luteolin可以誘導Hep-2細胞發(fā)生凋亡，并且隨作用時間延長、細胞凋亡率增加。而DAPI染色法的結(jié)果進一步從形態(tài)學上證實Luteolin不僅可以誘導Hep-2細胞發(fā)生凋亡，而且細胞凋亡率隨藥物濃度增大而增加。 4.在Luteolin誘導Hep-2細胞發(fā)生凋亡的過程中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9均被激活，三者的活性均隨著作用時

13、間延長而增加，但是，藥物作用1 2小時后以Caspase-8的活性增加最為突出并占居主導地位。 5.Luteolin可以降低Hep-2細胞內(nèi)cFLIPL蛋白的表達，并且與Caspases活化、Annexin-V/PI雙染法檢測到細胞凋亡的時間相吻合。隨著Luteolin作用時間延長cFLIP蛋白和mRNA的表達水平均下降，而Fas蛋白及其mRNA的表達水平均升高。 結(jié)論Luteolin作為一種很具有代表性的天然黃酮化合物

14、，不僅可以抑制體外培養(yǎng)的Hep-2細胞的增殖活性、引起細胞周期阻滯，并可誘導Hep-2細胞發(fā)生凋亡；Caspase-8和Caspase-9引導的信號通路均參與了Luteolin誘導的Hep-2細胞凋亡；而Luteolin可以通過降低cFLIP的mRNA和蛋白表達、上調(diào)Fas的mRNA和蛋白表達，從而活化Fas介導的信號通路在這一凋亡過程中發(fā)揮著重要作用?？傊?，Luteolin作為一種新型抗癌藥物有望用于包括頭頸部鱗狀細胞癌在內(nèi)的多種腫瘤