GST-EGFR融合蛋白沖擊樹突狀細(xì)胞治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、研究背景： 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC)是全球人類第六高發(fā)癌，目前主要治療手段是手術(shù)，結(jié)合輔助性放療和化療。雖然近三十年來在手術(shù)方式及放、化療技術(shù)上取得了進(jìn)步，但這些治療手段的進(jìn)步在提高HNSCC患者的5年生存率方面的作用卻非常有限。分子靶向性治療是目前腫瘤治療研究的一大熱點(diǎn)。鑒于在許多人類惡性腫瘤中，如HNSCC、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、和胰腺

2、癌等，均有過度表達(dá)表皮生長因子受體(Epidermal GrowthFactor Receptor，EGFR)的現(xiàn)象，且其表達(dá)水平與患者預(yù)后、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均有相關(guān)性，因此靶向EGFR的治療被認(rèn)為是一種很有前景的治療手段。其中EGFR的單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑是研究最為深入的兩種藥物，并已先后用于臨床。但是，臨床試驗(yàn)表明它們的療效比較有限。 利用腫瘤抗原沖擊致敏樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)激發(fā)免疫系

3、統(tǒng)針對該抗原的特異性免疫應(yīng)答是目前腫瘤免疫治療研究中的一個熱點(diǎn)。與EGFR的單克隆抗體及小分子酪氨酸激酶抑制劑通過阻斷EGFR的信號傳導(dǎo)通路來抑制腫瘤細(xì)胞生長不同，由DC疫苗所激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T-Lymphocyte，CTL)能直接殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，這種治療方法有著更高的治療效率。將EGFR作為靶點(diǎn)，使用EGFR蛋白沖擊致敏DC激活機(jī)體的主動免疫來治療高表達(dá)EGFR的HNSCC將可能是一種很有前景的新的治

4、療手段。目前這方面的研究還未見報(bào)道。本研究欲利用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-Transfcrase，GST)與EGFR的融合蛋白來沖擊致敏DC，進(jìn)行治療HNSCC的實(shí)驗(yàn)觀察。通過體外測定CTL殺傷靶細(xì)胞的能力及對荷瘤小鼠的腫瘤生長情況的觀察來探討該種治療方法的可行性，以期為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的治療找到一種新的治療策略。 研究目的： 重組GST-EGFR融合蛋白；分離培養(yǎng)并致敏DC；通過體外測定CTL殺傷靶

5、細(xì)胞的能力及T細(xì)胞分泌γ干擾素(Intefferon-γ，IFN-γ)的水平，明確GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC是否能誘導(dǎo)出抗腫瘤的細(xì)胞免疫；進(jìn)一步觀察用重組GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC對HNSCC荷瘤小鼠的治療作用。 研究方法： 1.構(gòu)建GST-EGFR融合蛋白原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)及純化。 2.分離培養(yǎng)DC，并用GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏。 3.致敏DC免疫小鼠后，取脾分離T

6、細(xì)胞，體外測定CTL活性，及T細(xì)胞分泌IFN-γ水平。 4.建立小鼠荷瘤模型，觀察GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC對HNSCC荷瘤小鼠的治療作用。 研究結(jié)果： 1.構(gòu)建GST-EGFR融合蛋白原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)及純化用RT-PCR擴(kuò)增高表達(dá)EGFR的小鼠HNSCC細(xì)胞株SCC Ⅶ的EGFR細(xì)胞外段編碼區(qū)cDNA，并測序鑒定，確定為預(yù)期片段。用擴(kuò)增產(chǎn)物成功構(gòu)建pGEX-4T-2-EGFR原核表達(dá)載體，經(jīng)

7、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并純化后，獲得87kDa大小的GST-EGFR融合蛋白；同時(shí)我們對pGEX-4T-2空載體也進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化后獲得26kDa大小的GST蛋白，兩種純化得到的蛋白純度均＞90％。 2.分離培養(yǎng)DC，并用GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏取C3H小鼠的后肢骨骨髓細(xì)胞，分離培養(yǎng)DC。培養(yǎng)第五天時(shí)流式細(xì)胞儀檢測CDllc陽性細(xì)胞占59.86％。之后分別用GST-EGFR融合蛋白及GST蛋白沖擊，于第七天流式細(xì)胞儀檢

8、測DC，結(jié)果CD40、CD80、CD86和MHC II(1-Ak)陽性細(xì)胞比例在GST-EGFR融合蛋白沖擊的DC組中分別為58.82％、59.88％、89.42％和90.28％，在GST蛋白沖擊的DC組中分別為54.32％、55.02％、88.36％和89.04％，在未用蛋白沖擊的DC組中分別為17.87％、42.84％、81.07％和80.36％。該結(jié)果顯示使用蛋白沖擊DC后，CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ(1-Ak)陽性

9、細(xì)胞比例均有提高。 3.致敏DC免疫小鼠，體外測定CTL活性，及T細(xì)胞分泌IFN-γ情況 3.1 CTL活性測定 CTL活性檢測結(jié)果顯示，在200：1、150：1、100：1和50：1不同的效靶比時(shí)，GST-EGFR／DC組靶細(xì)胞殺傷率分別為81.71±7.21％、64.05±5.9％、72.21±5.73％和70.51±15.73％，對照DC組的靶細(xì)胞殺傷率分別為7.69±2.32％、10.47±2.75％、8

10、.93±0.67％和9.13±1.09％，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性意義(P＜0.05)。然而，GST/DC組在不同的效靶比時(shí)其靶細(xì)胞殺傷率分別為9.47±4.42％、10.22±4.28％、6.76±3.53％和13.55±8.54％，對照DC組靶細(xì)胞殺傷率分別為8.99±5.07％、10.74±6.19％、8.24±3.55％和9.93±1.4％，兩組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(P＞0.05)。 3.2 測定T細(xì)胞IF

11、N-γ的分泌 IFN-γ,的測定結(jié)果顯示，GST-EGFR／DC組IFN-γ,濃度為250.36±4.83pg／ml，對照DC組為66.17±18.49pg／ml，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性意義(P＜0.05)。而GST／DC組IFN-γ濃度為84.47±12.96pg／ml，對照DC組為102.64±20.36pg／ml，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(P＞0.05)。 4.GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC抑

12、制SCC Ⅶ實(shí)體瘤生長的作用 4.1 GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC對腫瘤的治療作用 各組小鼠均于接受DC免疫之前先接種腫瘤細(xì)胞。DC組和GST／DC組小鼠在腫瘤體積上都表現(xiàn)出一種漸進(jìn)性的快速增長，在腫瘤細(xì)胞接種28天后，兩組的腫瘤體積分別為6626.59±1497.07mm3和6126.58±2134.65mm3，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(P＞0.05)；而GST-EGFR／DC組小鼠的瘤體體積增長速度

13、與DC組和GST／DC組相比要緩慢的多，在腫瘤細(xì)胞接種后的第28天，該組的腫瘤體積為3655.43±2238.51mm3，與DC組和GST／DC組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性意義(P＜0.05)。此外，GST-EGFR／DC組小鼠的平均生存時(shí)間為44±6.38天，也顯著長于DC組的36.43±4.24天和GST／DC組的37.17±3.13天，這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性意義(P＜0.05)。 4.2 GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏

14、的DC對腫瘤生長的預(yù)防作用 各組小鼠均在接受DC免疫之后再接種腫瘤細(xì)胞。DC組和GST／DC組小鼠的腫瘤體積在腫瘤細(xì)胞接種26天后分別為9309.32±3493.99mm3和8453.35±2049.26mm3，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(P＞0.05)；GST-EGFR/DC組小鼠的腫瘤生長較DC組和GST/DC組明顯減緩，在腫瘤細(xì)胞接種后的第26天該組的腫瘤體積為3911.5±1656.45mm3，與DC組和GST/D

15、C組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(P＜0.05)。GST-EGFR/DC組小鼠的平均生存時(shí)間為52.75±3.3天，也顯著長于DC組的43.75±5.74天和GST/DC組的41.6±5.37天，這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(P＜0.05)。 討論： 1.CDllc是小鼠DC的特異性表型，其測定結(jié)果能反映DC的純度，我們的結(jié)果與文獻(xiàn)中采用同樣方法分離培養(yǎng)DC所得的DC純度一致。CD40、CD80和CD86為共刺激

16、分子，DC成熟時(shí)它們的表達(dá)會增多，同時(shí)MHCⅡ的表達(dá)也會增多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用蛋白沖擊DC后，這些分子的表達(dá)均增加，提示DC成熟度上升。 2.CTL和IFN-γ的測定結(jié)果提示GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC能有效誘導(dǎo)靶向高表達(dá)EGFR的HNSCC的CTL，并使T細(xì)胞IFN-γ分泌水平上升，而該作用與GST蛋白無關(guān)。 3.動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果提示GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC同時(shí)具有治療性和預(yù)防性抗高表達(dá)EG

17、FR的HNSCC實(shí)體瘤的作用，能顯著抑制實(shí)體瘤的生長，并延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。同樣，該作用與GST蛋白無關(guān)。 結(jié)論： 1.成功獲得高純度GST-EGFR融合蛋白和GST蛋白。 2.分離致敏了DC。 3.GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC能有效誘導(dǎo)靶向高表達(dá)EGFR的HNSCC的免疫反應(yīng)。 4.GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC同時(shí)具有預(yù)防性和治療性抗高表達(dá)EGFR的HNSCC實(shí)體瘤作用。