神經(jīng)酰胺在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中作用和機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　頭頸部惡性腫瘤是全世界常見的惡性腫瘤，其中以頭頸部鱗狀細(xì)胞癌為主，占了頭頸部惡性腫瘤的90％。雖然近年來以手術(shù)為主，輔以放化療的治療手段不斷提高，但頭頸部鱗癌的五年生存率仍無明顯提高，患者的生存質(zhì)量也無明顯改善。為了尋求頭頸部鱗癌新的發(fā)病機(jī)制和治療的研究方向，本文將研究C2-神經(jīng)酰胺在頭頸部鱗癌中對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)和毒性作用及相關(guān)機(jī)制，以及與YAP蛋白表達(dá)的作用關(guān)系，以找尋頭頸部鱗癌疾病發(fā)生、發(fā)展過程中重要的蛋白分子，為

2、頭頸部鱗癌的治療研究提供理論基礎(chǔ)和新的發(fā)展方向，并有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和治療方法。
　　方法:
　　1.采用C2-神經(jīng)酰胺與泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK單獨(dú)或聯(lián)合處理頭頸部鱗癌細(xì)胞系，應(yīng)用光鏡和流式細(xì)胞術(shù)，觀察其誘導(dǎo)的頭頸部鱗癌細(xì)胞凋亡作用;應(yīng)用CCK-8實驗技術(shù)觀察其對頭頸部鱗癌細(xì)胞的增殖和活性的影響;通過蛋白免疫印跡法檢測cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)變化水平，從而探討C2-神經(jīng)酰胺對頭頸部鱗癌

3、細(xì)胞的凋亡作用和相關(guān)的作用機(jī)制。
　　2.采用C2-神經(jīng)酰胺與壞死抑制劑Nec-1單獨(dú)或聯(lián)合處理頭頸部鱗癌細(xì)胞系，應(yīng)用DNA瓊脂糖電泳技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，觀察其誘導(dǎo)的頭頸部鱗癌細(xì)胞程序性壞死的作用;應(yīng)用CCK-8實驗技術(shù)觀察其對頭頸部鱗癌細(xì)胞的增殖和活性的影響，從而驗證C2-神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細(xì)胞發(fā)生的程序性壞死作用。
　　3.采用C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細(xì)胞系，應(yīng)用電鏡、免疫熒光技術(shù)和蛋白免疫印跡法，觀察檢測自噬效

4、應(yīng)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)和自噬泡的形成;聯(lián)合采用自噬抑制劑氯喹(CQ)處理細(xì)胞，應(yīng)用CCK-8實驗技術(shù)觀察聯(lián)合用藥前后對細(xì)胞增殖和活性的影響;聯(lián)合采用MEK抑制劑PD98059處理細(xì)胞，應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測自噬相關(guān)通路蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin-1、p-ERK、p-AMPK、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)水平，并應(yīng)用CCK-8實驗技術(shù)觀察抑制劑作用前后對細(xì)胞增殖和活性的影響，從而探討C2-神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的頭頸部鱗癌細(xì)胞發(fā)生自噬對細(xì)胞的

5、保護(hù)作用以及可能的機(jī)制和相關(guān)信號通路。
　　4.應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測60例頭頸部鱗癌組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本中YAP蛋白的表達(dá)水平，通過統(tǒng)計學(xué)處理，分析蛋白表達(dá)與腫瘤的病理分級、患者性別之間的相關(guān)性;同時采用C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細(xì)胞系，應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測YAP蛋白的表達(dá)變化水平，探討YAP蛋白與頭頸部鱗癌發(fā)病的相關(guān)性以及與C2-神經(jīng)酰胺的作用關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1.C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細(xì)胞后，

6、細(xì)胞活性和增殖能力受到顯著抑制，凋亡細(xì)胞明顯增加，但細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平無明顯變化，且Z-VAD-FMK對C2-神經(jīng)酰胺的促凋亡作用無顯著影響，提示了C2-神經(jīng)酰胺能有效誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細(xì)胞發(fā)生非caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡作用。
　　2.C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)壞死細(xì)胞數(shù)明顯增加，而程序性壞死抑制劑能有效抑制C2-神經(jīng)酰胺處理后壞死細(xì)胞的產(chǎn)生并顯著抑制其誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，證

7、實了C2-神經(jīng)酰胺能有效誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細(xì)胞發(fā)生程序性壞死作用，并協(xié)同其誘導(dǎo)的凋亡作用，實現(xiàn)了抗癌的效果，而程序性壞死抑制劑能有效減弱這一效果。
　　3.C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量和LC3-Ⅱ、p-ERK表達(dá)水平顯著升高，而自噬抑制劑和MEK抑制劑能有效抑制其誘導(dǎo)的自噬作用并進(jìn)一步提升其對細(xì)胞活性和增殖的抑制作用，提示了C2-神經(jīng)酰胺能通過ERK1/2信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬作用，且自噬抑制劑能有效抑