STK33及NGFR在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述:
　　第一部分 STK33促進(jìn)下咽癌增殖與鈣離子相關(guān)性研究
　　目的:本文旨在在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和Mi croarray分析來(lái)探索STK33的功能，重點(diǎn)探索STK33的改變與鈣離子的可能關(guān)系。
　　方法:通過(guò)含有針對(duì)STK33的shRNA的慢病毒載體，感染細(xì)胞，并使用PCR法檢測(cè)慢病毒感染后Fadu細(xì)胞中STK33 mRNA表達(dá)的變化。進(jìn)行Microarray分析，尋找S

2、TK33基因敲除后的表達(dá)譜變化。注射Fadu細(xì)胞，Mock空載體細(xì)胞，以及STK33基因敲除細(xì)胞于5周雄性裸鼠右側(cè)腋下進(jìn)行皮下注射，定期測(cè)量腫瘤大小，并計(jì)算腫瘤體積，待對(duì)照組的腫瘤直徑達(dá)到1.5厘米時(shí)，收獲腫瘤和肺組織。在進(jìn)行蘇木素伊紅染色后，使用顯微鏡觀察腫瘤和肺的形態(tài)學(xué)改變，以了解Fadu細(xì)胞在體內(nèi)成瘤和侵襲轉(zhuǎn)移的能力。進(jìn)行免疫組化分析STK33蛋白的表達(dá)。使用MTT和吖啶橙染色檢測(cè)Ionomycin對(duì)Fadu細(xì)胞存活力及形態(tài)學(xué)改變

3、的影響。通過(guò)使用Fluo-3/AM染色，借助共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度進(jìn)行檢測(cè)。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blot檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:STK33-RNAi穩(wěn)定表達(dá)的Fadu細(xì)胞，感染空載體的Fadu細(xì)胞和對(duì)照Fadu細(xì)胞皮下注射到雄性裸鼠右側(cè)腋下后第14天對(duì)照Fadu細(xì)胞成瘤，共生長(zhǎng)39天?？蛰d體對(duì)照組和對(duì)照Fadu細(xì)胞組表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)率，在第39天時(shí)，體積達(dá)到約570mm3。

4、然而，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的STK33-RNAi表達(dá)的Fadu細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，在39天僅形成較小的腫瘤，體積約為90mm3。在STK33表達(dá)和不表達(dá)的細(xì)胞中腫瘤的體積有顯著差異。這表明STK33促進(jìn)HSCC在體內(nèi)的形成。免疫組化結(jié)果顯示STK33在STK33-RNAi細(xì)胞中的表達(dá)比載體對(duì)照組的細(xì)胞弱。注射對(duì)照組細(xì)胞的裸鼠的肺顯示存在轉(zhuǎn)移;相反，在注射STK33-RNAi細(xì)胞的裸鼠中未見(jiàn)轉(zhuǎn)移。
　　通過(guò)Microarray分析，在STK

5、33-RNAi細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)了140個(gè)有顯著差異的標(biāo)記基因。這些基因顯著（p＜0.05）上調(diào)(n=86)或者下調(diào)(n=54)。通過(guò)通路分析，我們發(fā)現(xiàn)STK33影響很多基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)很多通路。從中我們發(fā)現(xiàn)了Calpainl(CAPN1)，并用qRT-PCR確認(rèn)CAPN1的mRNA表達(dá)水平。在STK33-RNAi Fadu細(xì)胞中CAPN1的表達(dá)顯著下降（p＜0.05）。
　　Ionomycin可以迅速升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。在1.

6、5μ M的Ionomycin作用6小時(shí)后進(jìn)行吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)未處理的細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形，然而，典型的凋亡特點(diǎn)出現(xiàn)在Ionomycin處理的細(xì)胞中，包括細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝集，染色小體出現(xiàn)，表明Ionomycin可以誘導(dǎo)Fadu細(xì)胞凋亡。細(xì)胞存活率在Fadu細(xì)胞中顯示出明顯的隨Ionomycin作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì)。表明Ionomycin抑制細(xì)胞存活率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。在STK33-RNAi作用后細(xì)胞存活率顯著下降。此外，在ST

7、K33-RNAi與Ionomycin同時(shí)作用后，細(xì)胞存活率下降程度低于僅Ionomycin作用（p＜0.05）。與未處理的Fadu細(xì)胞相比，STK33的蛋白表達(dá)在1.5μ M Ionomycin作用1，2，4，6小時(shí)后升高。統(tǒng)計(jì)分析表明STK33的蛋白表達(dá)在作用1，2，4，6小時(shí)后比對(duì)照組顯著升高(p＜0.05)。這表明，Ionomycin可以增高STK33蛋白的表達(dá)。Fadu細(xì)胞中的CAPN1在1.5μM Ionomycin作用1，2

8、，4，6及24小時(shí)后CAPN1顯著升高(p＜0.05)。但在STK33-RNAi組中，作用前后沒(méi)有顯著性差異。
　　結(jié)論:shRNA介導(dǎo)的STK33基因的敲除抑制Fadu細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力，從而證明STK33本身對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。表明STK33在腫瘤形成中發(fā)揮重要作用。此外，通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)STK33在STK33-RNAi組所成腫瘤中的表達(dá)明顯下降。這表明STK33-RNAi仍然發(fā)揮它對(duì)STK33的敲除作用，藉以表明Fadu

9、細(xì)胞在以STK33-RNAi抗腫瘤影響的基礎(chǔ)上的增值能力的降低?？傊?，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了我們前期的從體外及臨床切除樣本中得到的STK33是一個(gè)潛在癌基因的研究結(jié)果。STK33基因通過(guò)多種信號(hào)通路在Fadu細(xì)胞中發(fā)揮作用。這個(gè)過(guò)程中包含大量決定腫瘤進(jìn)展中的重要功能的基因。CAPN1，在STK33-RNAi的干擾下顯著下調(diào)，正如本研究中進(jìn)一步PCR所證明的。本研究表明CAPN1的活性受STK33-RNAi的影響，提示CAPN1涉及STK3

10、3在Fadu細(xì)胞中誘導(dǎo)腫瘤形成的作用。這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能是一個(gè)很有吸引力的線索，在Fadu細(xì)胞中，STK33可能與鈣離子有關(guān)。因?yàn)镾TK33屬于CAMK家族。這促使我們關(guān)注STK33活性與Ionomycin作用后Fadu細(xì)胞內(nèi)鈣離子改變的關(guān)系。Ionomycin可以在體外抑制Fadu細(xì)胞的生長(zhǎng)。這表明Ionomycin通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度來(lái)表現(xiàn)出它對(duì)Fadu細(xì)胞的毒性作用。有意思的是，STK33-RNAi可以在一定程度上抵消Ionomyc

11、in引起的細(xì)胞損傷。表明STK33敲除可能保護(hù)細(xì)胞不受Ionomycin觸發(fā)的高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度而引起的細(xì)胞損傷。這為細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子可能通過(guò)STK33活性來(lái)影響CAPN1表達(dá)，從而影響一些與STK33在腫瘤發(fā)生中重要作用相關(guān)的重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提供了證據(jù)。
　　總之，本研究進(jìn)一步證明了STK33是一個(gè)潛在的癌基因，它通過(guò)調(diào)節(jié)眾多基因在HSCC腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。另外，在Fadu細(xì)胞內(nèi)的STK33和鈣離子存在相互的影響。

12、r>　　第二部分 NGFR在ESM1介導(dǎo)的口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤發(fā)生中的作用研究
　　目的:本研究在我們前期研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)通過(guò)小鼠OSCC細(xì)胞的Mi croarray分析和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探索NGFR的功能。
　　方法:使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)及ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。通過(guò)慢病毒感染細(xì)胞，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)MOC2細(xì)胞中的NGFR(MOC2T)，進(jìn)行Microarray分析，尋找NGFR基因

13、過(guò)表達(dá)后的表達(dá)譜變化。通過(guò)慢病毒感染細(xì)胞，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)MOC2細(xì)胞中的ESM1，敲除ESM1在MOC2和MOC2T細(xì)胞中的表達(dá)。使用MTT和Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)分析ESM1和NGFR對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。注射MOC2，MOC2-7，MOC2-10，MOC2-ESM1-SH，MOC2T和MOC2T-ESM1-SH細(xì)胞于6-11周B10; B6-Rag2-/-II2rg-/-小鼠右側(cè)后腿背側(cè)進(jìn)行皮下注射，定期測(cè)量腫瘤大小，

14、并計(jì)算腫瘤體積，收獲腫瘤和肺組織。在進(jìn)行蘇木素伊紅染色后，使用顯微鏡觀察腫瘤和肺的形態(tài)學(xué)改變。檢測(cè)ESM1是否參與血管形成，進(jìn)行免疫熒光分析血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)。
　　結(jié)果:通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NGFR在小鼠OSCC細(xì)胞系(MOC2，MOC2-7和MOC2-10)中表達(dá)。通過(guò)慢病毒感染，形成NGFR穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的MOC2細(xì)胞株，通過(guò)Micro

15、array分析尋找NGFR過(guò)表達(dá)后的基因表達(dá)譜改變。通過(guò)對(duì)Mi croarray結(jié)果的分析，我們發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1(endothelial cell specific molecule1，ESM1)。ESM1是一種新型的內(nèi)皮衍生的水溶性硫酸皮膚蛋白多糖，具有廣泛結(jié)合與細(xì)胞信號(hào)和粘附相關(guān)的生物活性分子的能力，從而調(diào)節(jié)健康和疾病中的不同類型細(xì)胞的增殖，分化，轉(zhuǎn)移和粘附。NGFR依賴的ESM1的mRNA水平的表達(dá)在NGFR過(guò)表達(dá)和N

16、GF處理的細(xì)胞中得到驗(yàn)證。ESM1的表達(dá)水平與小鼠OSCC細(xì)胞系的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力成正相關(guān)。ESM1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)MOC2細(xì)胞活力，遷移和侵襲能力。相反，ESM1的敲除抑制MOC2細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力。免疫缺陷小鼠皮下移植瘤表明ESM1的敲除減小腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移的克隆數(shù)目。降低NGFR過(guò)表達(dá)的MOC2細(xì)胞(MOC2T)的ESM1的表達(dá)也可以在體內(nèi)及體外降低MOC2T腫瘤增殖以及侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　總之，這是第一次報(bào)告ESM1