DcR3在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及相關機制研究.pdf

1、背景: 食管癌是人類八種最常見的惡性腫瘤之一。在全世界每年新增的30萬病例中，約70％發(fā)生在我國，并且其發(fā)病率仍呈上升趨勢。食管癌總體預后不佳，總的2年和5年生存率分別為35％～42％和15％N24％。食管癌主要分為食管鱗狀細胞癌(ESCC)和食管腺癌，而前者占了90％以上。因此，研究ESCC的發(fā)病機制，尋找其新的診斷和治療靶點，已經成為提高食管癌預防和治療效果的當務之急。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有一對矛盾貫穿始終，那就是機體的免疫

2、監(jiān)視和腫瘤的免疫逃逸。而誘導腫瘤特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應和瘤細胞自身生長停滯或凋亡是機體用以清除腫瘤細胞的主要手段。LIGHT及FasL介導的凋亡是體內最常見的凋亡模式，在免疫調節(jié)和腫瘤的免疫監(jiān)視中起著重要作用。DcR3是TNFRSF的一個新成員。研究發(fā)現，DcR3通過競爭性結合可以阻斷經由其配體FasL、LIGHT以及TLIA所介導的腫瘤細胞的凋亡；同時DcR3還可抑制免疫應答中T細胞的增殖并影響DCs的分化和成熟，并

3、抑制CD4+T細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)中的增殖；此外，DcR3還可抑制T細胞的趨化效應，降低T細胞與抗原提呈細胞間的相互作用。研究顯示，DcR3 mRNA低表達于正常人體組織中的胃、脊髓、淋巴結、肺、脾、結腸組織及多數造血細胞中，而高表達于胃腸道惡性腫瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、膠質細胞瘤和淋巴瘤等多種惡性腫瘤中。研究證實，高表達DcR3是腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視和殺傷的一個重要機制，其表達水平同多種腫瘤的進展程度、轉移情況、對化

4、療的抵抗性以及不良預后有明顯的相關性。因此，作為一種候選的腫瘤標志物和基因治療標靶，DcR3目前已經成為了腫瘤診斷和治療相關研究的熱點。研究DcR3 mRNA和蛋白在人ESCC細胞系和ESCC病人組織標本中的表達情況并分析DcR3的表達與疾病的侵襲、轉移、復發(fā)乃至預后間的關聯性，將有助于評價DcR3作為ESCC的臨床及預后的分子標志的可能性；而探討其表達調控的可能機制則將有助于ESCC腫瘤基因治療靶點的篩選。因此，關于DcR3在ESCC

5、病人中的高表達及其相關機制的研究對于該疾病的防治有相當重要的意義。 目的: 研究DcR3基因在ESCC病人腫瘤組織和相應的遠癌組織中的表達情況，分析DcR3基因的表達與病人臨床病理特征之間的關系，為評價DcR3作為ESCC的臨床及預后的分子標志提供實驗依據；檢測DcR3基因啟動子和編碼區(qū)的多態(tài)性位點在重慶地區(qū)漢族ESCC人群中的基因型和等位基因頻率，探討DcR3啟動子多態(tài)性與ESCC患病風險之間的關聯，篩查與ESCC腫瘤

6、組織中DcR3基因高表達相關聯的SNP位點，為進一步研究和分析影響其表達調控的分子機制奠定基礎；檢測DcR3基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)差異，探討ESCC腫瘤組織DcR3啟動子甲基化狀態(tài)是否參與其表達調控；考察DcR3 RNAi對ESCC腫瘤細胞的生長能力、侵襲能力和凋亡等方面的影響，初步探討DcR3在人ESCC細胞發(fā)生和發(fā)展過程中可能作用和機制。 方法: 1.收集109例ESCC腫瘤組織和對應的遠癌組織標本，通過半定量逆轉

7、錄聚合酶鏈反應(Semi-quantitative RT-PCR)檢測其中DcR3 mRNA表達情況； 2.運用免疫組織化學檢測52例ESCC病人腫瘤組織中DcR3蛋白表達情況并行半定量分析； 3.選取DcR3基因啟動子和編碼區(qū)四個多態(tài)性位點(-369G/T、-323A/C、-321C/T、147C/T)，通過PCR擴增產物測序的方法了解這些多態(tài)位點在重慶地區(qū)正常人群中的頻率分布，檢測上述多態(tài)位點在ESCC人群中的基因型

8、和等位基因頻率； 4.選擇4對DcR3 mRNA表達狀態(tài)有明顯差異的癌及相對應的遠癌組織標本，利用重亞硫酸鹽修飾后測序法(BSP)檢測DcR3基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)； 5.構建基于miR-30的、靶向DcR3的慢病毒干擾載體； 6.用干擾載體、包裝質粒pMD2G及包膜質粒psAX2共同轉染293FT細胞進行病毒包裝； 7.通過流式細胞儀(FACS)感染后的KYSE150細胞，獲得DcR3 RNAi的ES

9、CC細胞模型； 8.利用Real-time PCR和Western Blotting檢測DcR3 RNAi后瘤細胞上DcR3的表達情況； 9.繪制體外培養(yǎng)的感染細胞、對照細胞和親本細胞的生長曲線； 10.通過Transwell侵襲小室實驗檢測DcR3 RNAi與LIGHT-Fc協同作用對瘤細胞體外侵襲能力的影響； 11.運用Tunel試劑盒檢測DcR3 RNAi與LIGHT-Fc協同作用對瘤細胞凋亡的影響

10、。 結果: 1.ESCC腫瘤標本中DcR3 mRNA表達率為73.4％，而遠癌組織為47,7％(p<0.01)；分析發(fā)現DcR3 mRNA的表達與病人的性別、年齡、部位和組織分化程度沒有明顯的相關性，而與腫瘤組織的外侵程度(p<0.05)、區(qū)域淋巴結轉移情況(p<0.05)和臨床TNM分期(p<0.05)有較強的相關性； 2.ESCC腫瘤組織中DcR3蛋白的表達強弱與mRNA表達基本一致，DcR3的過表達率為28

11、.8％；DcR3的過表達與ESCC病人區(qū)域淋巴結轉移(p<0.05)和TNM分期(p<0.05)有明顯的相關性； 3.重慶地區(qū)漢族人群中-369G/T、-323 A/C、-321C/T三個位點不存在多態(tài)性；而147C/T位點等位基因C的頻率為43.7％，略高于中國漢族人(39.0％)和日本人(40.0％)。147C/T多態(tài)位點是與重慶地區(qū)漢族人群ESCC易感性相關聯的一個風險位點，而且該多態(tài)位點的等位基因型C具有顯性遺傳效應，攜

12、帶等位基因C的基因型CC和CT的ESCC發(fā)病JxL險顯著增加(p<0.05)。但該多態(tài)位點與ESCC腫瘤組織中DcR3蛋白的異常高表達無明顯的相關性； 4.DcR3陽性的腫瘤組織和DcR3陰性的遠癌組織，基因的啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)相同，即基因啟動子區(qū)所有的CpG位點都呈非甲基化狀態(tài)； 5.成功設計并構建了基于nuR-30的、靶向DcR3的慢病毒干擾載體；包裝獲得的病毒上清在體外能有效地感染人KYSE150細胞；

13、6.經FACS分選，Western Blotting檢測證實載體pPRIME-DcR3.31能有效地抑制瘤細胞DcR3的蛋白表達，抑制率為82.6％； 7.DcR3 RNAi對KYSE150細胞的體外生長無明顯影響； 8.DcR3 RNAi與LIGHT-Fc協同能有效地抑制瘤細胞的體外侵襲能力； 9.DcR3 RNAi明顯促進了LIGHT-Fc對KYSE150細胞的凋亡誘導。 結論: ESCC腫瘤

14、組織中DcR3在mRNA和蛋白質水平較之對應的遠癌組織存在明顯的高表達，其高表達與腫瘤的區(qū)域淋巴結轉移情況和臨床TNM分期有較強的相關性。重慶地區(qū)漢族人群中147C/T位點是與ESCC易感性相關聯的一個風險位點，該位點的等位基因型C具有顯性遺傳效應；ESCC病人腫瘤組織中DcR3的異常高表達與該基因CpG島的甲基化狀態(tài)異常無關；DcR3 RNAi對腫瘤細胞的體外生長沒有直接的抑制效應，但能與LIGHT-Fc協同，有效地抑制瘤細胞的體外侵