鋅α-,2-糖蛋白對肥胖小鼠血糖、脂代謝的影響及可能作用靶點的初步探討.pdf

1、鋅α<,2>糖蛋白對肥胖小鼠血糖、脂代謝的影響及可能作用靶點的初步探討目的：肥胖癥已成為危害全球人類健康的重要疾病，與2型糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、脂代謝異常、胰島素抵抗等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并可引起其他一些相關(guān)疾病如非酒精性肝病、哮喘以及關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生。肥胖癥形成的中心環(huán)節(jié)是脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的過度積聚，多種因素參與了此過程，但是具體形成機制還不完全清楚，而關(guān)于該方面的研究，對肥胖癥的防治有重要意義。鋅α<,2>糖蛋白(zi

2、nc-α<,2>-glycoprotein，ZAG)是最近新發(fā)現(xiàn)的一個脂肪細(xì)胞因子，可以促進(jìn)腫瘤惡液質(zhì)患者的脂肪分解，增加脂肪利用。但是ZAG與肥胖癥患者的脂肪堆積是否有關(guān)系，目前尚未有相關(guān)報道。 本研究擬用基因表達(dá)技術(shù)，觀察ZAG基因過表達(dá)對肥胖小鼠體重、內(nèi)臟脂肪含量、糖脂代謝等的影響以及在脂肪代謝中起關(guān)鍵作用的脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、激素敏感性脂肪酶(Hormone sensitive

3、 lipase，HSL)mRNA表達(dá)的變化，同時觀察正常人和肥胖患者減肥前后血清中ZAG蛋白水平的變化。通過以上這些觀察探討ZAG與肥胖癥的關(guān)系。 方法： 1、 小鼠ZAG蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-mZAG的構(gòu)建： 1.1 mZAG cDNA插入片段的擴增：從小鼠肝臟中提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，獲得小鼠ZAG cDNA全序列的大量擴增產(chǎn)物，并利用引物在其兩端引入酶切位點。 1.2 載體

4、片段的獲得：將本室保存的人ZAG蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-hZAG大量拷貝，經(jīng)EcoR V、HindⅢ雙酶切后，獲得大量載體片段。 1.3 應(yīng)用T<,4>DNA連接酶，將經(jīng)EcoR Ⅴ、HindⅢ雙酶切的小鼠ZAG cDNA全序列擴增產(chǎn)物與載體片段進(jìn)行連接，獲得小鼠ZAG表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-mZAG。 2、 pcDNA3.1(-)-mZAG表達(dá)質(zhì)粒的體外鑒定：應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.

5、1(-)-mZAG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞，40h后收集培養(yǎng)液，應(yīng)用western-blotting方法觀察ZAG蛋白的表達(dá)情況。 3、 采用高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型，觀察ZAG過表達(dá)對小鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量及糖脂代謝的影響：選擇6周齡的雄性昆明小鼠45只，分為5組：普通飼料組、高脂飼料組、ZAG過表達(dá)組、空白質(zhì)粒組、曲美組，每組9只。除普通飼料組外，其余四組均用高脂飼料喂養(yǎng)。5周后肥胖小鼠模型建立，然后進(jìn)行2周干預(yù)

6、試驗。ZAG過表達(dá)組用pcDNA3.1(-)-mZAG質(zhì)粒25μ g與lipofectamine2000脂質(zhì)體40ul混合后給予小鼠尾靜脈注射，隔日1次，共注射2周，空白質(zhì)粒組以pcDNA3．1(+)質(zhì)粒進(jìn)行注射，曲美組每天以曲美10mg/kg體重/d灌胃。干預(yù)兩周后處死小鼠，觀察小鼠攝食量、體重、附睪周圍脂肪重量、血糖、血脂等指標(biāo)。 4、 小鼠附睪周圍脂肪組織FAS、HSL mRNA的表達(dá)：從動物實驗中獲得的小鼠附睪周圍脂肪組

7、織中提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，檢測FAS、HSLmRNA的表達(dá)。 5、 正常人和肥胖患者減肥前后血清中ZAG蛋白表達(dá)水平的比較：正常人19人(男11人，女8人)，平均BMI為21.6。肥胖患者31例(男14人，女17人)，平均BMI為32.6，13例肥胖患者減肥后，BMI平均為29.6，減重5-10％，平均減重7.6kg，較減肥前顯著降低(P<0.05)。應(yīng)用western-blotting技術(shù)，利用抗人ZAG的單克隆

8、抗體，對血清中的ZAG的量進(jìn)行比較，并以同組標(biāo)本的血清β-actin的量作內(nèi)參照，觀察ZAG在不同BMI人群中的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1、 成功克隆小鼠ZAG cDNA全序列，并將其與pcDNA3.1(-)載體片段連接，構(gòu)建成pcDNA3.1(-)-mZAG表達(dá)質(zhì)粒。 2、 在體外培養(yǎng)的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系中，證實ZAG表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-mZAG可以在脂肪細(xì)胞中良好表達(dá)。 3、 高脂飼

9、料組、空白質(zhì)粒組、曲美組小鼠的血清ZAG水平分別為0.51±0.10、0.54±0.08、0.55±0.05，沒有顯著差別(P均>0.05)，但與普通飼料組(0.75±0.07)相比，均明顯降低(P均<0.01)。ZAG過表達(dá)組小鼠的血清ZAG水平為1.01±0.16，顯著高于普通飼料組及高脂飼料組(P均<0.001)，提示pcDNA3.1(-)-mZAG表達(dá)質(zhì)粒確實能在小鼠體內(nèi)表達(dá)ZAG蛋白。 4、 在2周的干預(yù)試驗中，高脂

10、飼料組、ZAG過表達(dá)組每只小鼠的攝食量平均分別為115.4±13.5g、115.8±7.5g，兩組間無差異(P=0.82)，均明顯高于普通飼料組(90.1±9.8g)(P均<0.001)。 高脂飼料組每只小鼠體重增加3.7±0.9g，明顯高于普通飼料組(2.7±0.7g)(P<0.01)。ZAG過表達(dá)組小鼠的總體重增加3.0±0.5g，明顯低于高脂飼料組(P<0.001)，與普通飼料組相比無差別(P=0.23)。 高脂飼

11、料組小鼠的內(nèi)臟脂肪占體重比例為2.22±0.48％，顯著高于普通飼料組(P<0.05)。ZAG過表達(dá)組小鼠的內(nèi)臟脂肪占體重比例平均1.16±0.10％，明顯低于高脂飼料組小鼠(P<0.001)及普通飼料組(P<0.05)。 高脂飼料組小鼠的空腹血糖為10.87±1.77 mmol/L，是普通飼料組的1.24倍(P<0.05)。ZAG過表達(dá)組小鼠的空腹血糖水平平均9.13±1.00 mmol/L，為高脂飼料組小鼠的84％(P<0.

12、05)，與普通飼料組無差異(P=0.55)。 高脂飼料組小鼠的低密度脂蛋白為1.10±0.24.mmol/L，明顯高于普通飼料組(0.59±0.44mmol/L)，為普通飼料組的1.86倍(P<0.001)。ZAG過表達(dá)組小鼠的血清低密度脂蛋白水平平均0.78±0.17 mmol/L，為高脂飼料組的71％(P<0.05)，與普通飼料組相比，無明顯差異(P=0.49)。 5、 高脂飼料組小鼠內(nèi)臟脂肪組織FAS：mRNA為4

13、.10±0.64．，明顯高于普通飼料組(2.67±0.46)，為后者的1.54倍(P<0.001)。ZAG過表達(dá)組小鼠脂肪組織FAS mRNA(1.54±0.39)表達(dá)顯著降低，為普通飼料組的58％，為高脂飼料組的38％(P均<0.001)。高脂飼料組小鼠內(nèi)臟脂肪組織HSL mRNA表達(dá)為1.18±0.19，明顯低于普通飼料組(1.98±0.25)，為后者的60％(P<0.01)。ZAG過表達(dá)組小鼠脂肪組織HSL mRNA為4.39±0

14、.95，較普通飼料組和高脂飼料組均明顯增加，分別為普通飼料組和高脂飼料組的2.22倍和3.72倍(P均<0.001)。 6、 正常人血清ZAG蛋白水平平均為0.74±0.10，肥胖患者血清ZAG蛋白水平顯著低于正常人(P<0.05)。減肥后，ZAG蛋白水平較減肥前有所增加(P<0.05)，但仍明顯低于正常人水平(P<0.05)。正常人、肥胖患者及肥胖患者減肥后，血清ZAG蛋白水平與BMI均不具有相關(guān)關(guān)系(r分別為0.16、0.3

15、4、0.25，P均>0.05)。 結(jié)論： 1、 成功構(gòu)建了pcDNA3.1(-)-mZAG表達(dá)質(zhì)粒，在體內(nèi)、體外均能良好表達(dá)鼠源ZAG蛋白，是研究ZAG作用的一種有效工具。 2、 ZAG可使高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠，體重增加減少，內(nèi)臟脂肪含量減少，血清低密度脂蛋白降低，表明ZAG具有減輕體重，減少脂肪積聚的作用，有一定的減肥效果。 3、 ZAG可能通過作用于小鼠脂肪組織FAS和HSL兩個靶點，抑制脂肪合成，促進(jìn)