肥胖,代謝綜合征對小鼠尿控功能的影響及機制探討.pdf

1、研究背景：
　　從上世紀末至本世紀初，肥胖（obesity）已經(jīng)成為了一種廣泛存在社會現(xiàn)象。在世界范圍內(nèi)可預防的引發(fā)死亡和疾病的相關因素中，肥胖占領先地位，無論是兒童還是成年人，肥胖癥的比率一直在上升。
　　肥胖一般認為是由于脂類，尤其是甘油三酯在體內(nèi)過多聚集所導致的一種病理狀態(tài)，可分為單純性肥胖和繼發(fā)性肥胖兩種類型，日常生活中所見到的肥胖一般為單純性肥胖，所占的比例在所有肥胖癥的95％以上，醫(yī)學上認為單純性肥胖為原發(fā)性肥胖

2、，與個人遺傳因素，飲食和運動習慣相關。目前，肥胖問題已不再局限于發(fā)達國家，對于經(jīng)濟快速發(fā)展的地區(qū)，在人們的飲食習慣改變及品種供應日益豐富和生活方式向靜態(tài)變化的趨勢下，肥胖問題也迅速發(fā)展。在我國，自20世紀90年代與80年代起，超重者的比例已增加了近1倍，達到20-30%，城市人口中達到35-40%；我國大多人依然認為肥胖是由于飲食過度及不注意個人飲食及運動習慣造成的，不將其視作一種疾病，從而使得肥胖癥控制欠佳而更為普遍，進而引發(fā)糖尿病，

3、心血管疾病，腫瘤及睡眠-呼吸紊亂等疾病，近來更多的研究認為肥胖更是引發(fā)代謝綜合征的主要危險因素。
　　代謝綜合征（metabolic syndromes，MetS）是近10年來受到普遍重視的一類疾病綜合征群，其主要表現(xiàn)為中心性肥胖，高血壓，高血糖，糖耐量異常（胰島素抵抗），高密度脂蛋白膽固醇血清水平降低，血脂代謝紊亂和微量蛋白異常等，其與糖尿病，代謝性疾病及心血管疾病的發(fā)病密切相關且發(fā)病率逐年攀升，在北美地區(qū)，MetS發(fā)病率已達3

4、4-39%，嚴重影響了人類的身心健康及生活質(zhì)量，已成為了世界性的公共衛(wèi)生問題。
　　前列腺增生癥（BPH），是以前列腺兩側(cè)葉和中葉增生為主所引起的老年男性常見疾病之一，往往伴有下尿路癥狀（LUTS）；下尿路癥狀是一系列以排尿不適癥狀形成的綜合征候群，已有大量證據(jù)表明肥胖，腰圍，體質(zhì)指數(shù)及體脂分布等與BPH和LUTS的發(fā)病相關。隨著肥胖與代謝綜合征研究的不斷深入。近年來，MetS與 BPH，LUTS，膀胱過度活動癥（OAB）及勃起功

5、能障礙(ED)等泌尿生殖系疾病的相關性研究成為了熱點。雖然已經(jīng)有部分臨床研究報道表明了在人體MetS與BPH，LUTS具有相關性，但由于此類研究領域仍較新，研究時間有限，動物實驗及分子機制依然不清，實驗方法及相關結(jié)論也不完善，大量臨床結(jié)論的基礎研究證據(jù)依然空白，缺乏完善的動物實驗來進行佐證，動物實驗是進一步了解分子機制最有效的方式，建立合理有效的動物模型對深入了解疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用。因此，我們嘗試使用肥胖動物模型來研究關于肥胖與代

6、謝綜合癥在泌尿系并發(fā)癥的影響，并對其代謝綜合征誘導的下尿路癥狀下分子通路表達進行了初步研究。
　　研究目的：
　　1.以肥胖小鼠（B6.V-Lepob/J，obob mice）為研究對象，觀察肥胖可能導致代謝綜合征的特點，并行尿流動力學實驗，了解肥胖，代謝綜合征對尿控及排尿功能的改變情況；
　　2.對兩組小鼠存在明顯差異的指標進行相關性及回歸分析，了解造成排尿習慣改變的潛在危險因素并探討相關分子機制，為臨床實驗及研究提

7、供證據(jù)支持；
　　研究方法：
　　1.動物模型的建立：擬使用雄性瘦素（leptin）受體敲除小鼠（B6.V-Lepob/J小鼠）為實驗組，正常C57BL/6N品系雄性小鼠為對照組（n=40）飼喂普通飼料28周，觀察不同時間點小鼠體重（BW），身長(BL)，腰圍(WC)，血糖水平(BG)，空腹糖耐量（GTT），胰島素水平(INS)，總膽固醇含量（TCHO），游離脂肪酸水平(FFA)的變化情況；
　　2.按照時間點分布，觀

8、察小鼠尿動力學情況，通過尿量頻率實驗和膀胱內(nèi)壓檢查實驗共同實現(xiàn)；
　　3.通過影像學核磁共振檢查，了解實驗中期和末期肥胖對前列腺及體脂分布情況的影響；并就相對顯著指標與排尿頻率進行相關性分析；
　　4.對28周后的小鼠組織行免疫組織化學染色和western blot（WB）檢測相關蛋白表達情況；
　　結(jié)果：
　　1. Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠較正常C57BL/6N小鼠更易于表現(xiàn)出包括中心性肥胖

9、，高血糖，高胰島素血癥，血清總膽固醇升高等MetS癥狀；
　　2. Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠較正常C57BL/6N小鼠易于出現(xiàn)下尿路改變，表現(xiàn)為排尿次數(shù)增多，膀胱儲尿容量改變，單次尿量減少，基礎膀胱壓及排尿壓峰值增高及排尿間隔時間減少等表現(xiàn)；
　　3.影像學核磁共振檢測Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠較正常C57BL/6N小鼠具有更大的前列腺及內(nèi)臟脂肪體積；
　　4.對兩組小鼠中具有統(tǒng)計

10、學差異的數(shù)據(jù)行Person相關性分析后表明：體重指數(shù)（R=0.638），腹腔內(nèi)脂肪含量（R=0.853），前列腺體積（R=0.706），空腹血糖水平（R=0.712），血清胰島素水平（R=0.628）與血清膽固醇（R=0.729）含量與排尿頻率強相關；年齡（R=0.437），體重（R=0.483），腰圍（R=0.469），血清總膽固醇含量（R=0.467）與排尿頻率弱相關；(p<0.05)；
　　5.免疫組織化學HE染色顯示B6.

11、V-Lepob/J小鼠較正常對照組小鼠的前列腺組織中腺體細胞大量增生，有少量炎性細胞浸潤；WB結(jié)果顯示 B6.V-Lepob/J小鼠較正常對照組小鼠前列腺中的TGF-β表達增高；
　　結(jié)論：
　　1. Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠可以作為新型研究代謝綜合征的動物模型，具有特征性，可重復性及相對穩(wěn)定性；
　　2. Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠可出現(xiàn)下尿路癥狀，主要以尿頻癥狀為主，其與代謝綜

12、合征癥狀及腹腔脂肪分布具有正相關性；
　　3.血糖水平，胰島素水平，前列腺體積及腹部脂肪體積均是下尿路癥狀產(chǎn)生的危險因素，其中高血糖是下尿路癥狀的獨立危險因素；
　　研究背景：
　　尿失禁是一種以不自主尿液流出為主要癥狀的疾病，往往是由于膀胱括約肌功能下降或者是神經(jīng)性功能損傷造成，雖然其發(fā)病對機體造成的損傷并不嚴重，但卻會極大的降低患者的生活工作質(zhì)量并影響其心理健康，且以女性多發(fā)，容易誘發(fā)患者出現(xiàn)自閉，抑郁及孤僻特點[

13、1]。尿失禁在分類上有4種類型：壓力性尿失禁最為常見，多由于膀胱盆腔組織松散所致；急迫性尿失禁常因膀胱過度活動癥（overactive bladder，OAB）引發(fā);混合型尿失禁則兩者兼有，還有一類為功能性尿失禁，常由于藥物及疾病等因素導致膀胱貯尿功能下降所致。目前全球統(tǒng)計的年輕女性尿失禁人群已占到20%-30%，30-40歲的中年女性發(fā)病率為30-40%及老年女性發(fā)病率增高達到30-50%；尿失禁的危險因素包括有年齡，種族與遺傳因素，

14、肥胖，分娩胎次等，其中尤以分娩對產(chǎn)道及盆底組織損傷最為常見，分娩產(chǎn)傷導致的盆底神經(jīng)，肌肉的機械性損傷，同時可伴有缺血缺氧出現(xiàn)的局部組織氧化應激加重損傷，病患隨著年齡增長，尿失禁的癥狀出現(xiàn)并有加重趨勢。
　　正常生理條件下，機體內(nèi)存在多種氧自由基及抗氧化酶，平衡著機體的氧化及抗氧化平衡，在炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，可能會誘導產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物會加重細胞和組織損傷，機體的抗氧化系統(tǒng)亦包括兩種類型，一類以酶類抗氧化系統(tǒng)為

15、主，包括有超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px）等；另一類則為非酶抗氧化系統(tǒng)，包括維生素C、維生素 E、麥角硫因、谷胱甘肽等。在酶類抗氧化系統(tǒng)中，SOD作為最主要的抗氧化酶之一發(fā)揮著重要的作用，在分型上，SOD也可分為3類：SOD1。SOD2及SOD3,常在研究中用于機體的抗氧化應激能力的測評。
　　長期的高熱量，高脂肪飲食會誘發(fā)肥胖，高血糖癥，胰島素抵抗，高脂血癥等一系列代謝綜合征表現(xiàn)

16、，在胰島素抵抗情況下，生物機體抗感染及抗氧化應激能力也隨之下降；壓力性尿失禁與產(chǎn)傷相關已有大量證據(jù)報道，產(chǎn)傷過程中缺血缺氧情況下產(chǎn)生的氧化應激對機體的損傷及長期預后依然不清，有待更多合理的實驗進一步研究探討。
　　研究目的:
　　在上述背景基礎上，我們設計了該課題實驗，以 MnSOD平滑肌特異性敲除小鼠為研究對象，嘗試發(fā)掘氧化應激，尤其是平滑肌中MnSOD缺乏情況下小鼠尿失禁發(fā)生情況，更好的理解MnSOD對于尿失禁的作用意義

17、。
　　研究方法：
　　1.基因敲除動物：采用Cre-LoxP技術特異性敲除雌性小鼠（C57BL/6）平滑肌MnSOD基因，然后運用聚合酶鏈反應（PCR）及免疫組化技術，對子代進行基因型鑒定，對符合條件保留的條件敲除小鼠納入實驗組（n=48），同時納入相同數(shù)量的C57BL/6品系雌性小鼠為對照組（n=48）；
　　2.再將實驗組小鼠與對照組小鼠與12周齡時進一步分亞組，分別使用高脂飼料（80%脂肪）及普通飼料飼喂12周

18、，檢測4組小鼠的在時間分布上的一般生長情況（體重，腰圍，體重指數(shù)），血糖變化，排尿功能；
　　3.24周后行陰道內(nèi)球囊擴張模擬分娩產(chǎn)傷過程，測量術后4天，10天，20天的漏尿點（Leak point pressure。LPP）水平進而評估其尿失禁水平；
　　4.實驗結(jié)束取動物組織標本進行蛋白分析及形態(tài)學等體外實驗；
　　結(jié)果：
　　1.基因型分析中PCR及4-羥基壬烯醛(HNE)免疫組化切片顯示MnSOD基因已基

19、本敲除；
　　2.飼喂高脂飲食的小鼠較普食小鼠體重明顯增加，血糖增高，糖耐量異常，但組間無差異，飼喂普通飲食的小鼠無論基因敲除與否，體重未見明顯改變，組間亦無統(tǒng)計學差異；
　　3.飼喂高脂飲食合并基因敲除的小鼠在陰道擴張術后4天，10天時LPP水平明顯低于其余組，普通飼料喂食的對照組小鼠 LPP水平最高，10天后基本達正常水平，各組中大多數(shù)小鼠在術后20天LPP水平基本恢復到正常水平；
　　4.飼喂高脂飲食小鼠尿道在術

20、后4天抗氧化蛋白SOD表達水平低于正常小鼠；以MnSOD敲除組為著，術后20天后，各組SOD表達水平基本恢復正常；
　　結(jié)論：
　　1. Cre-LoxP技術可用于MnSOD特異性平滑肌敲除小鼠的制備；
　　2.高脂飲食可誘導肥胖，高血糖，糖耐量異常等代謝綜合癥的出現(xiàn)；
　　3. MnSOD敲除后小鼠的漏點壓水平降低，但這種水平降低可以被長期飼喂高脂飲食加重，也可以隨時間恢復；
　　4.抗氧化蛋白，尤其是M