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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:目前,心腦血管病已經(jīng)在發(fā)展中國(guó)家開始蔓延,成為世界首位的死亡原因,嚴(yán)重地危害著人類的生命和健康,而心力衰竭作為各種心臟病發(fā)展的嚴(yán)重階段,正在成為本世紀(jì)最重要的心血管病癥。有流行病學(xué)資料顯示,全球心衰患者的數(shù)量以每年約200萬的速度遞增,并且心衰的病死率高,5年存活率與惡性腫瘤接近?,F(xiàn)已明確,各種原因引起的心肌重構(gòu)是導(dǎo)致心衰發(fā)生發(fā)展的基本病理生理基礎(chǔ)。
心肌重構(gòu)是由一系列復(fù)雜的分子及細(xì)胞機(jī)制導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的
2、變化。其心肌生物學(xué)特征改變包括:心肌細(xì)胞凋亡;病理性心肌細(xì)胞肥大;心肌細(xì)胞外基質(zhì)降解增加或過度纖維化。其心臟幾何學(xué)特征改變?yōu)?心肌重量和心室容量的增加;心室形狀的改變;心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變,最終導(dǎo)致心功能失代償,即心力衰竭。臨床多種疾病均可導(dǎo)致心肌重構(gòu),如高血壓、糖尿病、肥胖、冠心病、瓣膜病等。
近年來,肥胖及糖、脂代謝紊亂等非血流動(dòng)力學(xué)因素對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用日益受到重視。代謝綜合征(Metabolic syndrome,
3、MS)為肥胖、血脂紊亂、高血壓、血糖調(diào)節(jié)受損或胰島素抵抗等多種心血管疾病危險(xiǎn)因素的簇集。MS及其各組分均可對(duì)心臟結(jié)構(gòu)及功能造成顯著的影響,其中以左心室結(jié)構(gòu)改變?yōu)樽钤缙诤妥钔怀龅谋憩F(xiàn),有研究表明,左室結(jié)構(gòu)改變是心臟病患者病死率上升的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前,MS在我國(guó)發(fā)病率逐年上升,因此,防治MS心肌重構(gòu)已成為治療的首要目標(biāo)。預(yù)防MS所致心肌損傷、延緩左室重構(gòu),可改善心力衰竭的長(zhǎng)期臨床預(yù)后。
乙醛脫氫酶2(Aldehyde dehyd
4、rogenase,ALDH2)是線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶,能夠?qū)⒏鞣N外源性和內(nèi)源性醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸,減少醛類物質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。研究表明,心臟缺血-再灌注損傷過程中,ALDH2活性與心肌梗死面積高度負(fù)相關(guān),提示ALDH2具有重要的心肌保護(hù)作用;另有研究顯示,ALDH2可通過代謝4-HNE等毒性醛類而在心肌梗死過程中起到抗心肌細(xì)胞凋亡并改善心室重構(gòu)的作用。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者在ALDH2心肌保護(hù)方面開展了部分研究,但MS導(dǎo)致的心肌損傷
5、、重構(gòu)是否與ALDH2的表達(dá)和活性抑制有關(guān),過表達(dá)ALDH2是否可以起到MS心肌的保護(hù)作用,其作用是否與調(diào)控JNK/AP-1有關(guān),迄今未見報(bào)道。
因此,推測(cè):MS導(dǎo)致的心肌損傷重構(gòu)過程與內(nèi)源性ALDH2表達(dá)和活性的下降有關(guān),過表達(dá)或增強(qiáng)ALDH2活性可以起到干預(yù)MS心肌重構(gòu),改善心功能,進(jìn)而起到MS心肌的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與ALDH2減輕氧化應(yīng)激,調(diào)控JNK/AP-1表達(dá),改善胰島素抵抗,減少心肌細(xì)胞凋亡及心肌間質(zhì)纖維化
6、有關(guān)。
本課題立足于ALDH2與MS心肌保護(hù)之間存在著密切關(guān)系,以心肌細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化為切入點(diǎn),我們采用高脂飲食誘導(dǎo)MS小鼠模型,超聲和組織學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)與功能異常,明確MS小鼠心肌ALDH2活性與心功能的關(guān)系;過表達(dá)ALDH2,進(jìn)而探討ALDH2對(duì)MS小鼠心肌重構(gòu)發(fā)展過程中JNK/AP-1及心肌細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化等重要因子表達(dá)的影響,不僅有助于闡明ALDH2干預(yù)MS心肌重構(gòu)的內(nèi)在分子機(jī)制,而且可以為該酶靶點(diǎn)
7、的心肌保護(hù)作用提供新的思路和治療策略。
研究目的:1.高脂飲食誘導(dǎo)MS小鼠心肌重構(gòu),評(píng)價(jià)MS小鼠心肌重構(gòu)的特征改變;
2.觀察MS小鼠心肌ALDH2表達(dá)及活性變化趨勢(shì),探討ALDH2活性是否與心功能EF值呈正相關(guān);
3.評(píng)價(jià)ALDH2對(duì)MS小鼠心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化的影響,探討ALDH2對(duì)MS小鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用;
4.探討ALDH2干預(yù)MS小鼠心肌重構(gòu)的具體分子作用機(jī)制,為臨床干預(yù)MS
8、心肌重構(gòu)提供新的治療靶點(diǎn)。
研究方法:高脂飲食誘導(dǎo)建立MS小鼠模型:將90只雄性C57 BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組,n=15只)和模型組(n=75只)。NC組以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng);模型組以高脂飼料喂養(yǎng)。飼料具體配方構(gòu)成比為基礎(chǔ)料61%,豬油27.5%,酪蛋白8.5%,膽固醇1.2%,膽酸鈉0.2%,磷酸氫鈣0.6%,石粉0.6%,添加劑0.4%。喂養(yǎng)10周后將造模成功的55只MS小鼠隨機(jī)分為三組:MS組(n=15只),
9、繼續(xù)以高脂喂養(yǎng);ALDH2載體組(n=20只),繼續(xù)高脂喂養(yǎng),并左心室注射ALDH2慢病毒載體;GFP組(n=20只),繼續(xù)高脂喂養(yǎng),并左心室注射不攜帶ALDH2重組基因的GFP載體。轉(zhuǎn)染慢病毒載體4周后,處死動(dòng)物,留取心臟組織備用。
實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行以下指標(biāo)監(jiān)測(cè):(1)每2周應(yīng)用電子秤測(cè)量小鼠體重。(2)小鼠開始喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)10周及轉(zhuǎn)染病毒載體4周后,檢測(cè)血清總膽固醇(Totalcholesterol,TC)、甘油三酯(Tri
10、glycerides,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Lowdensity lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、空腹血糖(Fasting blood glucose,F(xiàn)BG)以及胰島素(Fasting blood insulin,F(xiàn)INS),并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗評(píng)價(jià)指數(shù)(Homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR, HOMA-IR=FB
11、GxFINS/22.5)。(3)小鼠開始喂養(yǎng)10周及轉(zhuǎn)染載體4周后,應(yīng)用高分辨顯微超聲儀測(cè)量小鼠舒張末期左室內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter,LVESD),并計(jì)算左室質(zhì)量(left ventricular mass,LVM)、射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction,EF)及左
12、室短軸縮短率(Left ventricular short axis reduced rates,F(xiàn)S)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物,留取心臟標(biāo)本,進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn):(1)分光光度法測(cè)定線粒體ALDH2活性。(2)透射電鏡檢測(cè)小鼠心肌超微結(jié)構(gòu);心肌組織病理學(xué)檢測(cè)(HE染色、Masson染色)心肌結(jié)構(gòu)及心肌纖維化。(3) TUNEL法檢測(cè)左室心肌細(xì)胞的凋亡率;JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位。(4) DCF法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。(
13、5)免疫組化染色檢測(cè)心肌組織4-HNE含量。(6)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA表達(dá),β-actin基因用作內(nèi)參基因。(7) Western blot法檢測(cè)p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser307)、IRS-1、p-AKT、AKT、caspase-3以及ALDH2蛋白表達(dá),β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行定量分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS17.
14、0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),干預(yù)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);三組以上比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多組間兩兩比較采用LSD(Least significant difference)檢驗(yàn);各指標(biāo)間相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
研究結(jié)果:1.MS小鼠模型成功建立
在模型建立過程中,模型組小鼠共死亡5只,并剔除不符合MS標(biāo)準(zhǔn)的小鼠后,最
15、終55只成模,正常對(duì)照組無死亡。轉(zhuǎn)染后, ALDH2載體組及GFP組各死亡6只,陽(yáng)性對(duì)照組死亡1只,最終共57只小鼠完成實(shí)驗(yàn):NC組(n=15只),MS組(n=14只),ALDH2載體組(n=14只),GFP組(n=14只)。
C57 BL/6J小鼠高飼喂養(yǎng)10周后,表現(xiàn)出明顯的MS特征。與NC組比較,模型組小鼠體重增加,血清TC、TG、LDL-C、FBG及FINS增高,計(jì)算HOMA-IR升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
16、。表明經(jīng)10周高飼喂養(yǎng),已成功建立了MS小鼠模型。
2.ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠各項(xiàng)代謝指標(biāo)及體重
轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體4周后,與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組血清FBG、FINS水平下降,計(jì)算HOMA-IR降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);體重、TG、TC、LDL-C有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3.各組小鼠心肌ALDH2活性及蛋白表達(dá)的變化
與NC組小
17、鼠比較,MS組小鼠心肌線粒體ALDH2活性明顯下降(P<0.01);其ALDH2活性下降約40%;與NC組小鼠比較,MS組小鼠ALDH2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體后,小鼠心肌ALDH2蛋白表達(dá)及活性明顯升高(P<0.01)。
4.轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體對(duì)MS小鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響
MS組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于NC組小鼠(P<0.01),而ALDH2組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平
18、較MS組降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。4-HNE免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,MS組小鼠心肌4-HNE含量高于NC組小鼠(P<0.01);與MS組和GFP組相比較,ALDH2組小鼠4-HNE含量明顯下降(P<0.01)。提示ALDH2活性及蛋白表達(dá)增高,可有效清除4-HNE,進(jìn)而改善小鼠心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)。
5.ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能
與NC組相比,MS組小鼠LVEDD及LVESD顯著增加(
19、P<0.01),EF及FS顯著下降(P<0.01)。與MS組和GFP組相比,ALDH2組小鼠LVEDD及LVESD顯著下降,且EF及FS顯著提高(P<0.05)。
6.ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠心肌形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)
HE染色結(jié)果顯示,與NC組比較,MS組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,可見肌纖維斷裂。與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組心肌結(jié)構(gòu)紊亂有所改善。
透射電鏡結(jié)果顯示,NC組可見肌纖維沿長(zhǎng)軸整齊排列
20、,肌小節(jié)及明暗帶清晰規(guī)則;線粒體豐富,大小較一致;細(xì)胞間質(zhì)可見成纖維細(xì)胞和少量膠原纖維。MS組及GFP組肌纖維排列紊亂,Z線消失明顯;胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,線粒體腫脹、空泡化,自噬體出現(xiàn),可見凋亡小體;間質(zhì)充滿增生的膠原纖維,膠原纖維走形紊亂,斷裂。與MS組及GFP組相比,ALDH2組肌纖維的排列較為整齊,線粒體腫脹、空泡化明顯改善;膠原纖維明顯減少,排列相對(duì)整齊。
7.ALDH2轉(zhuǎn)染后可通過調(diào)控JNK/AP-1表達(dá),影響IRS-1
21、/AKT/caspase3通路以減少心肌細(xì)胞凋亡
TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核可被染色為棕褐色或棕黃色的顆粒。TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞在NC組小鼠心肌細(xì)胞中數(shù)量極少,而在MS組小鼠心肌細(xì)胞中明顯增多,有顯著性差異(P<0.01);與MS組及GFP組相比,ALDH2組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,有顯著性差異(P<0.01)。
JC-1檢測(cè)線粒體膜電位變化:與NC組比較,MS組及GFP組小鼠線粒體膜電位
22、明顯下降(P<0.01)。與MS組及GFP組比較,ALDH2組線粒體膜電位升高(P<0.05)。
Western blot法檢測(cè)重要因子蛋白表達(dá):與NC組比較,MS組及GFP組p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser307)、IRS-1、caspase-3蛋白表達(dá)升高,p-AKT/AKT蛋白表達(dá)下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MS組及GFP組比較,ALDH2組p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser307)
23、、caspase-3蛋白表達(dá)下降,p-AKT/AKT蛋白表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
8.ALDH2轉(zhuǎn)染后可通過調(diào)控JNK/AP-1表達(dá),進(jìn)而通過抑制TGF-β1/膠原合成以減少心肌纖維化
Masson染色結(jié)果顯示,NC組的心肌間質(zhì)膠原組織排列整齊,分布較均勻;與NC組相比,MS組和GFP組膠原纖維明顯增多,圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維排列紊亂甚至斷裂;與MS組及GFP組相比,ALDH2組膠原纖維則明顯減
24、少,排列較規(guī)則整齊。膠原定量分析顯示: MS組心肌CVF升高,膠原相對(duì)含量較NC組明顯增多(P<0.01);ALDH2組膠原相對(duì)含量較MS組明顯減少(P<0.05)。
RT-PCR檢測(cè)TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA表達(dá):與NC組比較,MS組及GFP組小鼠心肌TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA表達(dá)均上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組小鼠心肌TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA
25、表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
研究結(jié)論:(1)通過高脂飲食喂養(yǎng)C57 BL/6小鼠可誘導(dǎo)與人類MS相類似的MS模型。該模型存在左室結(jié)構(gòu)改變、心肌細(xì)胞凋亡增多、心肌間質(zhì)纖維化等心肌重構(gòu)特征,為本研究提供了可靠的動(dòng)物模型。
(2) MS小鼠心肌重構(gòu)過程中ALDH2表達(dá)及活性均下降,ALDH2活性與心功能EF值呈明顯正相關(guān)。
(3)ALDH2可通過清除4-HNE,改善胰島素抵抗,起到保護(hù)MS小鼠心
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