體外循環(huán)期間心肌代謝變化及乙醛脫氫酶2活化的心肌保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 基于代謝組學(xué)的體外循環(huán)缺血再灌注期間心肌代謝特點(diǎn)研究
　　研究目的:
　　體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass，CPB)缺血再灌注期間臨床干預(yù)以及機(jī)體的自身調(diào)節(jié)機(jī)制使心肌代謝發(fā)生復(fù)雜變化，然而缺乏系統(tǒng)性全面分析，本研究旨在利用代謝組學(xué)技術(shù)全面探索缺血再灌注期間心肌代謝變化特點(diǎn)。
　　研究方法:
　　18只新西蘭白兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C組，n

2、=6）、缺血組（I組，n=6）、缺血再灌注組（IR組，n=6），同時(shí)需12只新西蘭白兔作為I組及IR組供血兔。體外循環(huán)經(jīng)右腋動(dòng)脈、右房插管進(jìn)行動(dòng)脈灌注和靜脈引流，左腋動(dòng)脈置管入主動(dòng)脈根部或主動(dòng)脈根部荷包縫合插管進(jìn)行停搏液的灌注。正常對(duì)照組正中開胸、體外循環(huán)插管后直接取左室心肌組織，缺血組主動(dòng)脈阻斷120min后取左室心肌組織，缺血再灌注組主動(dòng)脈阻斷120min，心肌恢復(fù)灌注120min后取左室心肌組織。心肌代謝特點(diǎn)采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)

3、進(jìn)行分析，對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析(PCA，OPLS-DA法)，作得分圖、載荷圖、熱力圖(heat map)分析，結(jié)合OPLS-DA分析的VIP值與t檢驗(yàn)的p＜0.05共同鑒定差異物質(zhì)。
　　研究結(jié)果:
　　I組與C組相比，代謝特點(diǎn)可被區(qū)分但差異不明顯(Q2Y=0.357)，確定13個(gè)代謝物在I組與C組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（VIP差異物＞1，p差異物＜0.05），兩組間差異代謝物質(zhì)主要與脂肪酸、氨基酸、核苷酸代謝相關(guān)。K

4、EGG分析發(fā)現(xiàn)，代謝通路主要渉及鳥氨酸循環(huán)及嘧啶代謝的抑制。IR組代謝特點(diǎn)與I組明顯不同(OPLS-DA分析模型Q2Y=0.714)，得分圖可完全分開，對(duì)圖形區(qū)分產(chǎn)生貢獻(xiàn)的物質(zhì)組成載荷圖，最終可確定82個(gè)代謝物在IR組與I組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(VIP差異物＞1，p差異物＜0.05)，兩組間差異代謝物質(zhì)主要與能量、氨基酸、脂肪酸、核苷酸的代謝相關(guān)，涉及少量糖代謝產(chǎn)物，京都基因和基因組的百科全書(Kyoto Encyclopedia of

5、Genes and Genomes，KEGG)分析發(fā)現(xiàn)代謝通路主要涉及脂肪酸、氨基酸、糖酵解產(chǎn)物的生成增加，鳥氨酸循環(huán)的激活，此外與氧化應(yīng)激相關(guān)的氨基酸、黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)代謝產(chǎn)物增加，而抗氧化代謝產(chǎn)物減少。
　　研究結(jié)論：
　　本研究全面分析了缺血期間與再灌注期間心肌組織的代謝特點(diǎn)，確定了多條代謝通路的變化。研究發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)心肌缺血期間，僅涉及到部分脂肪酸代謝、鳥氨酸循環(huán)、嘧啶代謝產(chǎn)物的差異變化。再灌注早期心肌恢復(fù)血供，脂肪

6、酸、氨基酸、核苷酸代謝明顯上調(diào)，但同時(shí)參與氧化應(yīng)激的氨基酸、不飽和脂肪酸也明顯增加，抗氧化劑谷氨酰胺生成減少，通過本研究推斷再灌注損傷可能與心肌代謝中參與氧化應(yīng)激代謝物質(zhì)上調(diào)相關(guān)，因此本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步探索缺血再灌注心肌保護(hù)的復(fù)雜機(jī)制及心肌保護(hù)的改進(jìn)策略。
　　第二部分 ALDH2活化在兔體外循環(huán)模型中的心肌保護(hù)效果及機(jī)制研究
　　研究目的:
　　既往研究表明，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物醛類的堆積與心肌功能的損傷密切相關(guān)，線粒

7、體乙醛脫氫酶2(ALDH2)可有效清除毒性醛類物質(zhì)，但體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass，CPB)期間受低溫、醛類物質(zhì)反向抑制、個(gè)體差異等因素影響，ALDH2活性受抑制，而ALDH2的活化對(duì)體外循環(huán)缺血再灌注心肌是否具有保護(hù)效應(yīng)及具體機(jī)制尚無報(bào)道。因此本研究基于兔CPB心臟停跳模型，應(yīng)用Alda-1特異性激活A(yù)LDH2，探討其對(duì)體外循環(huán)期間心肌保護(hù)效果及可能的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象為健康

8、新西蘭白兔，15-20周齡，體重2-3.5kg。第一階段：實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為體外循環(huán)組（C組，n=7）、體外循環(huán)停跳組（CA組，n=7）、體外循環(huán)停跳+Alda-1組（CAA組，n=7）;第二階段：實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為體外循環(huán)停跳組(CA組，n=7)、體外循環(huán)停跳+渥曼青霉素組（CAW組，n=7），體外循環(huán)停跳+Alda-1組(CAA組，n=7)，體外循環(huán)停跳+Alda-1組+渥曼青霉素組（CAAW組，n=7）。另隨機(jī)分配35只新西蘭白兔作為供血

9、兔。所有新西蘭白兔采用右腋動(dòng)脈插管及右房插管建立CPB模型，降溫至直腸溫30℃，阻斷升主動(dòng)脈，灌注心臟停搏液，主動(dòng)脈阻斷2h后開放，復(fù)溫至直腸溫35℃以上生命體征平穩(wěn)后停機(jī)，恢復(fù)心肌灌注2h取左室心肌組織。術(shù)中監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、直腸溫、血?dú)庾兓?。停機(jī)后取左室心肌標(biāo)本，心肌組織勻漿測(cè)ALDH2含量活性，以及4-羥基壬烯醛(4-HNE)、丙二醛(MDA)、蛋白羰基、氧化型與還原型谷光甘肽(GSH/GSSG)含量、AKT磷酸化水平、自噬指標(biāo)

10、LC3I/I表達(dá)，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變和線粒體損傷情況，檢測(cè)CPB前、升主動(dòng)脈阻斷前、主動(dòng)脈阻斷120min、升主動(dòng)脈開放后5min、停機(jī)后血?dú)饧癈K-MB變化趨式。
　　研究結(jié)果:
　　缺血再灌注期間4-HNE、MDA堆積，與C組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(4-HNE：pCA vsC＜0.001;MDA：pCAvsC=0.001)。ALDH2含量在組間比較無明顯差異，應(yīng)用Alda-1后，CAA組與CA組相比ALDH2活

11、性明顯增加(pCAAvsCA＜0.001)，心肌4-HNE、MDA的堆積明顯減輕(4-HNE:pCAAvsCA=0.013;MDA:pCAAvsCA＜0.001)。應(yīng)用Alda-1后心肌蛋白羰基水平、血清CK-MB明顯減低，GSH/GSSH增加，CAA組與CA組相比均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，停機(jī)后CAA組dp/dtmax較CA組明顯升高(p=0.040)，但LVEDP、LVESP、dp/dtmin在三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此外研究

12、發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ在CAA組較CA組明顯降低，但TUNEL凋亡陽性細(xì)胞在三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第二階段結(jié)果表明，PI3K-AKT通路抑制劑渥曼青霉素的應(yīng)用可明顯抑制再灌注期間心肌AKT磷酸化與微管相關(guān)蛋白(LC3)表達(dá)，CAW組與CA組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。CAA組與CA組、CAAW組比較發(fā)現(xiàn)，4-HNE、AKT磷酸化水平均增加，自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ明顯下降，組間比較存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)
　　差異(p＜0.05)。

13、
　　研究結(jié)論:
　　1.體外循環(huán)期間ALDH2活化可加強(qiáng)毒性醛類清除，增強(qiáng)心肌的抗氧化損傷能力，減輕心肌的氧化應(yīng)激水平，心肌收縮功能得以改善，此外本研究還發(fā)現(xiàn)再灌注期間自噬程度明顯減輕，但TUNEL檢測(cè)凋亡陽性細(xì)胞無明顯差異。
　　2.再灌注期間，ALDH2可能通過AKT活化負(fù)向調(diào)節(jié)自噬水平，進(jìn)而改善再灌注期間心肌損傷，但具體調(diào)節(jié)分子機(jī)制及下游通路仍待進(jìn)一步探索.
　　3.本研究在體外循環(huán)模型中證實(shí)，ALDH2