HDAC5在NOD鼠脾CD4+T細胞中的異常表達與糖尿病腎病的關系.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是一種常見和嚴重的以微血管病變?yōu)橹鞯奶悄虿〔l(fā)癥，是終末期腎病(end-stage renaldisease，ESRD)的主要原因之一，我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其發(fā)病原因和病理機制仍不明確，大部分的研究認為與高血糖、血流動力學改變、遺傳和環(huán)境因素、性別因素、糖尿病持續(xù)時間等密切相關。近年來研究發(fā)現(xiàn)T細胞過度活化以及炎性浸潤是糖尿病腎損傷的主要免疫病理機制。而表觀遺傳在調(diào)節(jié)T

2、細胞基因表達以及細胞分化成熟、活化中起重要作用。
　　表觀遺傳學(epigenetics)是20世紀80年代逐漸興起的新興學科，是指在基因編碼的DNA序列不變的前提下，通過某些機制產(chǎn)生可遺傳的基因表達或細胞表型的改變。其主要機制包括DNA甲基化(DNA methylation)、組蛋白修飾(Histone Modification)和小RNA干擾(microRNA interference)等。其中組蛋白乙酰化是最重要的修飾之一，

3、是基因表達的主要驅動力。組蛋白的乙?；揎検窃诮M蛋白乙酰化酶(Histone acetyltransferase，HATs)和組蛋白去乙?；?Histonedeacetyltransferase，HDACs)的共同調(diào)節(jié)下維持動態(tài)平衡，并與基因的轉錄激活密切相關。轉錄活躍區(qū)域的核心組蛋白乙?；潭雀撸D錄關閉區(qū)域核心組蛋白乙酰化程度低。HAT能乙?；诵慕M蛋白，使相關區(qū)域的染色質(zhì)結構松散，起始轉錄;HDAC能去除核心組蛋白的乙?；揎?/p>

4、，使相關區(qū)域染色質(zhì)超螺旋，抑制RNA聚合酶以及相關轉錄因子與DNA的結合，關閉轉錄。HDACs與HATs的功能相反，能通過去除組蛋白乙?；揎梺黻P閉轉錄。人類中已發(fā)現(xiàn)的HDACs共有18種，根據(jù)與釀酒酵母的三種HDACs(apd3、Hdal和Sir2)的同源性可分為三類:第1類與酵母的apd3同源且結構相近，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC11;第2類與酵母Hdal有相近的催化結構，又可分為A亞類和B亞類，Ⅱ

5、A類是轉錄共遏制因子(Corepressor)，包括HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9。ⅡB類包括HDAC6、HDAC10。第2類與第1類催化活性相近，但結構和功能上卻明顯不同;第3類與酵母中的Sir2同源，目前已鑒定出7種，分別為SirT1-7。
　　隨著研究的不斷推進，大量我們已經(jīng)了解和明確的分子機制牽涉進糖尿病并發(fā)癥特別是DN的病理機制中。蛋白激酶C(Proteinkinase C，PKC)和活性氧(reacti

6、ve oxygen species，ROS)是現(xiàn)在公認的導致糖尿病腎損傷的重要信號分子。大量促炎癥因子和促纖維化因子例如:轉化生長因子(transforming growth factor-b1，TGF-b1)，結締組織生長因子(connective tissue growth factors，CTGF)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，a-平滑肌肌動蛋白(a-smoo

7、th muscle actin，a-SMA)和細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)蛋白等在糖尿病患者腎臟表達上調(diào)。內(nèi)源性抗纖維化細胞因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein-7，BMP7)和 E-鈣粘蛋白的表達降低。多種促或抗纖維化相關基因在DN患者腎臟細胞的異常表達提示我們，可能有某種上游分子機制的失衡影響了相關基因的表達。組蛋白去乙?；?HDAC)可以通過調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；?/p>

8、水平調(diào)控基因轉錄。有研究表明HDAC抑制劑能有效保護DN患者的腎臟，明顯緩解臨床癥狀。提示我們HDAC表達異?？赡軈⑴c到DN的病理過程中。通過比較非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic mouse，NOD)發(fā)病前后的腎臟病理，發(fā)現(xiàn)發(fā)病后的NOD鼠腎小球中有T、B和CD11c+樹突狀細胞浸潤，并伴有IgG和補體C3的沉積。此外，從NOD鼠的血清中可以檢測到抗自身腎小球成分的自身抗體。而這些現(xiàn)象在未發(fā)病的非糖尿病NOD小鼠

9、中未觀察到。可見，糖尿病腎病的發(fā)生與免疫細胞的功能異常密切相關。本研究前期試驗發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比1型糖尿病患者CD4+T細胞組蛋白H3，H4乙?；黠@降低，HDAC5表達水平顯著升高，且H3乙?；档退脚c患者血糖水平明顯負相關。提示我們CD4+T細胞總體組蛋白低乙?；约癏DAC5表達異常升高可能導致其功能異常，進而參與到糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)病機制中。本課題選用糖尿病模型NOD鼠為研究對象，通過檢測NOD鼠發(fā)病過程中CD4+T細胞

10、總體H3，H4乙?；揭约癏DACs的改變，并與相關指標做相關性分析，進一步明確CD4+T細胞組蛋白乙?；揎棶惓ＥcDN發(fā)生發(fā)展之間的關系。
　　第一部分脾臟CD4+T細胞組蛋白乙?；揎椗cNOD鼠糖尿病腎病發(fā)病的關系
　　第一節(jié)不同周齡NOD鼠脾臟CD4+T細胞H3，H4總體乙?；胶拖嚓P修飾酶譜的研究
　　目的:
　　檢測不同周齡NOD鼠脾臟CD4+T細胞H3，H4總體乙?；胶拖嚓P修飾酶譜。
　

11、　方法:
　　將NOD鼠進食飲水自由隨機分為4組，于12，18，24和30周取NOD小鼠脾臟分離CD4+T細胞，抽提組蛋白，總RNA和總蛋白。用美國Epigentek公司的H3，H4總體乙?；疎LISA試劑盒檢測NOD鼠CD4+T細胞組蛋白H3，H4總體乙酰化水平。實時定量PCR(Real Time PCR)檢測NOD鼠脾臟CD4+T細胞組蛋白乙?；嚓P修飾酶的mRNA水平。Western Blot進一步驗證Real Time P

12、CR篩選出的陽性基因，并將異常表達的修飾酶與H3，H4乙?；鱿嚓P性分析。明確NOD鼠脾臟CD4+T細胞H3，H4乙?；男揎棤顟B(tài)，探討其與DN的相互關系。
　　結果:
　　通過檢測我們發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的發(fā)展24和30周齡NOD鼠脾臟CD4+T細胞H3，H4總體乙酰化水平明顯低于12周齡小鼠，而且周齡越大H3，H4總體乙酰化水平越低。18周齡鼠H3，H4總體乙?；铰缘陀?2周齡鼠。Real Time PCR檢測乙酰化相關修

13、飾酶發(fā)現(xiàn)與12周齡NOD鼠相比，24周齡和30周齡鼠P300，PCAF，HDAC2mRNA水平明顯下降，而HDAC5 mRNA水平則顯著性升高，CREBBP表達水平無變化。18周齡NOD鼠與12周齡鼠相比僅HDAC5 mRNA水平略有升高，其余無顯著性差異。Western Blot結果顯示24和30周齡NOD鼠脾臟CD4+T細胞HDAC5蛋白表達水平明顯高于12周齡鼠。
　　結論:
　　隨著NOD鼠疾病的進展，其脾CD4+T

14、細胞總體H3，H4乙?；矫黠@降低，組蛋白去乙?；窰DAC5表達水平明顯升高，且二者呈顯著負相關。
　　第二節(jié) NOD鼠CD4+T細胞異常的組蛋白乙?；揎椗c糖尿病腎病相關指標的關系
　　目的:
　　檢測不同周齡NOD小鼠隨機血糖和微量尿白蛋白排泄量，并與對應的CD4+T細胞H3，H4總體乙酰化水平和HDAC5水平做相關性分析，明確CD4+T細胞中HDAC5表達水平與DN的關系。
　　方法:
　　每周用

15、血糖儀和試紙檢測NOD小鼠的隨機血糖，取12，18，24和30周每只NOD小鼠血糖記錄分析。提尾反射法收集各周齡小鼠尿液，美國RB公司的ELISA試劑盒分別檢測尿白蛋白和肌酐，計算尿白蛋白/肌酐比率得出尿白蛋白排泄率。
　　結果:
　　與12周齡鼠相比24和30周齡鼠血糖濃度以及尿白蛋白/肌酐比率顯著升高，18周齡NOD鼠血糖略有升高，尿白蛋白/肌酐比率無明顯變化。24和30周齡鼠H3，H4乙?；脚c尿白蛋白/肌酐比率顯著

16、負相關，HDAC5水平與尿白蛋白/肌酐比率顯著正相關。
　　結論:
　　CD4+T細胞中HDAC5的異常升高與NOD鼠腎功能的損害密切相關。
　　第二部分 siRNA表達質(zhì)粒干擾組蛋白去乙酰化酶HDAC5的表達
　　目的:
　　利用siRNA技術構建HDAC5的干擾質(zhì)粒，篩選出有效干擾靶點，為后期干預NOD鼠脾臟CD4+T細胞做準備。
　　方法:
　　根據(jù)genebank提供的HDAC5 mRN

17、A序列，使用ambion提供的在線設計工具BLOCK-iTTM RNAi Designer查找干擾靶點。將待選靶序列克隆進pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA質(zhì)粒，并將克隆成功的質(zhì)粒電轉染小鼠CD4+T細胞，Real Time PCR和Western Blot檢測干擾效率，篩選出有效靶點。
　　結果:
　　利用BLOCK-iTTM RNAi Designer找出4條評分最高的HDAC5干擾靶點，并成功克隆進干擾載體。

18、通過Real Time PCR和WesternBlot檢測出siRNA-HDAC5-2干擾效果最好。
　　結論:
　　siRNA技術可成功干預小鼠CD4+T細胞HDAC5的表達。
　　第三部分 siRNA-HDAC5對NOD鼠組蛋白修飾異常的干預及其治療作用
　　目的:
　　通過干預NOD鼠脾臟CD4+T細胞HDAC5的表達，檢測腎功能相關指標，評估siRNA-HDAC5對NOD鼠的治療作用，進一步明確HD

19、AC5與DN之間的關系。
　　方法:
　　將小鼠隨機分為三組，即siRNA-HDAC5，siRNA-Control和生理鹽水組。于18，24和30周齡取樣本檢測。Real-time PCR檢測各組NOD鼠CD4+T細胞CD11a、CCR5、以及CX3CR1轉錄水平。ELISA檢測各組NOD鼠血清IL-1，IL-6，IL-18和TNF-α水平。血糖儀檢測各組NOD鼠血糖，ELISA檢測各組NOD鼠尿白蛋白排泄率。最后常規(guī)病理檢

20、測各組NOD鼠腎臟。
　　結果:
　　與未干預對照組相比，HDAC5干預組小鼠脾CD4+T細胞CD11a、CCR5、以及CX3CR1明顯降低。血清IL-1，IL-6，IL-18，TNF-僅細胞因子水平，以及血糖和尿白蛋白排泄率均顯著降低。腎臟病理結果顯示與對照組相比，干預組24周齡鼠腎小球病理損傷無明顯改變，30周齡鼠僅可見系膜細胞輕度增生，基質(zhì)略有增多，中性粒細胞浸潤較少，基底膜未見明顯增厚;間質(zhì)內(nèi)少量炎癥細胞浸潤，腎小管