Ⅰ白介素-17調節(jié)致糖尿病性T細胞介導的NOD鼠1型糖尿病的發(fā)生;Ⅱ長期飲酒減少大鼠睪丸間質細胞PBR和StAR表達.pdf

1、目的: ①研究逆轉錄病毒轉染BDC T細胞能否穩(wěn)定的表達和分泌IL-17； ②研究siIL-17能否在BDC T細胞的基因表達中抑制IL-17基因的表達。 ③觀察IL-17轉基因BDC T細胞體內能否誘導NOD.scid轉移性糖尿病的發(fā)生，以及siIL-17能否通過BDC T細胞基因表達抑制IL-17的表達和體內抑制糖尿病的發(fā)生。④研究IL-17對1型糖尿病發(fā)病影響的機理。 研究方法: 1、IL-

2、17和siIL-17的病毒載體的構建： 借助于MSCV-IRES-Thy1.1逆轉錄病毒載體，通過基因重組的方法攜帶IL-17基因；以Thy1.1作為病毒載體上的目的基因的檢驗標志；以攜帶抗凋亡基因Bcl2的重組MIT和空載體MIT為陽性對照；以空白轉導作為陰性對照。 以pMND-BANSHEE逆轉錄病毒為載體，插入U6增強子和Thy1.1實驗標志，構成了完整的逆轉錄病毒載體。siIL-17插入其多克隆位點，構建了siI

3、L-17逆轉錄病毒載體。 2、Phoenix細胞生產病毒顆粒： Phoenix細胞培養(yǎng)和傳代至對數(shù)生長期，在鈣.磷轉導試劑的作用下，加入目的病毒DNA，轉染包裝細胞，培養(yǎng)24小時即可收獲攜帶目的基因的病毒上清。轉染前后使用Thy1.1抗體和流式細胞儀鑒定Phoenix細胞。 3、BDC T細胞的活化： 以anti-mouse CD3和anti-mouse CD28體外共刺激脾細胞約24小時后，通過標記CD

4、4和Vβ4抗體，流式細胞儀檢測BDC T細胞的性質；標記CD69和CD62L抗體鑒定T淋巴細胞的活化率。 4、BDC T細胞的病毒感染和IL-17的表達： 目的病毒感染BDC T淋巴細胞。細胞培養(yǎng)后，流式細胞儀檢測Thy1.1和Thy1.2抗體標記的雙陽性T細胞的百分率并篩選出。ELISA檢測雙陽性T細胞培養(yǎng)液IL-17表達，確定轉染效果。 5、轉基因BDC T細胞的接種及效果： 通過目的病毒感染，大量生

5、產轉基因BDC T細胞，以抗體-磁珠篩選的方法，篩選出Thy1.1/Thy1.2雙陽性細胞并注射NOD.scid鼠，以注射BDC T細胞和PBS作為陰性對照組，觀察動物血糖變化。 6、ELISA方法檢測NOD.scid小鼠血漿腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α)、干擾素-gamma(IFN-γ)和白細胞介素-6(IL-6)以及白細胞介素-4(IL-4)，并送檢胰腺進行病理檢查，及流式細胞學檢查脾臟和胰腺淋巴結。 結果:

6、1、細胞克隆生產的重組逆轉錄病毒為分別攜帶目的基因IL-17和siIL-17的病毒DNA.測序和酶切結果和預期結果完全一致。 2、攜帶目的基因的病毒載體轉染Phoenix包裝細胞：抗體標記和流式細胞學鑒定轉導Phoenix細胞呈Thy1.1陰性，轉導后， MIT空載體、重組Bcl2-MIT質粒、重組IL-17質粒和siIL-17質粒的轉導率分別是(96.14±4.2)％，(93.2±2.2)％，(93.5±3.2)％和(89.5

7、±4.7)％，與空白對照組(0.4±0.1)％相比，均有顯著性差異(P＜0.01)。 3.BDC T細胞的活化：分別用CD4/CD69和CD4/CD62L抗體標記活化前、后的脾細胞，與活化前比較，活化后BDC T細胞比例增加，活化前、后CD4+/CD69+細胞和CD4+/CD62L-細胞的比例分別由(3.4+1.5)％和(8.6+2.8)％提高至(33.74±6.9)％和(25.54±5.3)％，提示CD4+細胞處于較理想的被轉

8、染狀態(tài)。 4.攜帶目的基因的逆轉錄病毒轉染活化的T淋巴細胞：在Mock空白對照組、MIT空載體組，Bcl2陽性對照組、IL-17組和siIL-17組中，Thy1.1+/Thy1.2+細胞比例分別為(0.64±0.3)％，(7.2±2.4)％，(6.84±2.6)％，(6.44±2.4)％和(4.6±1.8)％。 5、轉基因BDC T細胞的篩選和鑒定：以Thy1.1、Thy1.2和BDC2.5TCR抗體標記被篩選的細胞，并

9、進行流式細胞學分析顯示：①經Thy1.25和IBDC2.5TCR抗體標記證實被篩選的細胞是BDC2.5 T細胞，②與篩選前對比，Thy1.1和Thy1.2抗體標記的雙陽性IL-17轉基因細胞從(5.14±2.4)％提高到(97.2±1.2)％，siRNA-IL-17轉基因細胞從(4.64±1.6)％提高到(83.2±6.3)％。 6.轉基因NOD/BDC T細胞IL-17的體外表達：IL-17轉基因T淋巴細胞的IL-17水平顯著

10、升高，活化后可進一步促進IL-17的表達。siIL-17轉基因T淋巴細胞可顯著抑制IL-17的表達，IL-17的水平顯著降低。 7、NOD.scid鼠血糖監(jiān)測和組織學檢查： 至觀察期結束，注射IL-17轉基因BDC T細胞的NOD.scid小鼠血糖顯著升高，全部小鼠均發(fā)生糖尿病，而注射siIL-17細胞的NOD.scid小鼠、陰性對照組和BDCT細胞組無一例發(fā)病。胰腺組織學H&E染色發(fā)現(xiàn)注射IL-17轉基因BDC T細胞

11、的NOD.scid小鼠表現(xiàn)為嚴重的胰島炎和胰島結構破壞，模糊不清。而注射silb-17的轉基因NOD.scid小鼠和BDC T細胞組多表現(xiàn)為輕、中度胰島炎，陰性對照組表現(xiàn)為正常胰島。 8、NOD.scid鼠血漿IL-17、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-4水平： 注射IL-17BDC T細胞的小鼠血漿IL-17、TNF-α、IFN-γ和IL-6水平均顯著高于siIL-17小鼠和對照組(P＜0.01)，而siIL-17小鼠

12、各項血漿細胞因子水平與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。血漿IL-4水平在IL-17小鼠中未測出，在siIL-17小鼠和對照組中極低。未能檢測出NOD.scid小鼠血漿各項細胞因子。 9、流式細胞學結果顯示，在IL-17糖尿病發(fā)病組，脾臟和胰腺淋巴結BDC T增殖和聚集增多，樹突細胞(DC)細胞顯著增加。 結論: 1、以逆轉錄病毒為載體攜帶IL-17和siIL-17基因轉染BDC T細胞，可以體外獲得顯著高表達

13、的IL-17 BDC T細胞和低表達IL-17 BDC T細胞，而siIL-17基因表達可以有效抑制BDC T細胞中IL-17的表達。 2、Phoenix包裝細胞是一個安全有效的逆轉錄病毒“包裝機”。 3、轉移高表達IL-17的轉基因BDC T淋巴細胞可誘發(fā)和加速NOD.scid鼠糖尿病的發(fā)生，表達siIL-17的BDC T細胞可通過抑制IL-17的表達抑制NOD.scid鼠糖尿病的發(fā)生。 4、IL-17可刺激自

14、身的BDC T活化，導致淋巴細胞胰島浸潤，并通過促進DC活化和BDC T細胞釋放TNF-α、IFN-γ、IL-6細胞因子和抑制IL-4細胞因子，最終破壞胰島D細胞，誘發(fā)糖尿病。 5、DC細胞可以通過抗原遞呈介導高表達IL-17的BDC T細胞活化增殖和胰島β細胞損害。 基于上述研究現(xiàn)狀，為了更深入的認識乙醇與PBR、StAR的關系和對睪酮的作用機理，本研究確定研究目的與方法如下： 目的: 1、通過對大

15、鼠睪丸組織染色，觀察乙醇對大鼠睪丸組織的基本影響； 2、檢測大鼠血清睪酮水平，了解乙醇對大鼠血清睪酮的抑制作用： 3、檢測乙醇喂養(yǎng)大鼠睪丸StAR mRNA的表達水平；檢測睪丸組織PBR和StAR的表達，了解乙醇對PBR和StAR在基因轉錄和蛋白質水平上的影響； 4、明確PBR和StAR在睪丸組織中的定位，觀察定位組織蛋白表達情況。 研究方法: 1、動物模型培養(yǎng)。為檢測慢性乙醇對大鼠睪丸組織的影響

16、，Wistar大鼠隨機分成四組，每組給予不同劑量的乙醇胃管灌注，每天一次，共20周。麻醉后處死，迅速取睪丸置于液氮保存或4％多聚甲醛中固定、脫水、包埋，制成組織蠟塊備用。 2、采用H&E染色，顯示睪丸組織的乙醇影響狀況。 3、采用羅氏全自動E170電化學發(fā)光儀測定大鼠血清睪酮水平。 4、采用RT-PCR檢測StAR mRNA水平；采用免疫共沉淀和Western-blot檢測PBR和StAR蛋白水平。 5、采用免疫