microRNAs在活化的小鼠CD4+T細(xì)胞與MDSC中的表達(dá)模式.pdf

1、目的：
　　近年來大量研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）參與調(diào)控包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的病理進(jìn)程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在RA患者血漿中存在9種差異性表達(dá)的miRNA，其中miR-342-3p、miR-181d、miR-122-3p、miR-9-5p在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠血漿中也存在差

2、異性表達(dá)；且RA及CIA小鼠模型中CD4+T細(xì)胞和髓樣抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells， MDSC）均呈活化增殖狀態(tài)并在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。因此本研究旨在探討小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞與骨髓MDSC在體外活化擴(kuò)增狀態(tài)下miR-342-3p、miR-181d、miR-122-3p、miR-9-5p的表達(dá)情況，以便于進(jìn)一步了解CD4+T細(xì)胞與 MDSC的活化擴(kuò)增機(jī)制，并為深入探討 miRNA在

3、免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)及以RA為代表的自身免疫性疾病中的作用提供新的思路。
　　方法：
　?。?）使用牛Ⅱ型膠原和弗氏佐劑誘導(dǎo)CIA小鼠模型，于造模第45天運用流式細(xì)胞術(shù)檢測CIA小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的比例以及CIA小鼠骨髓、脾臟、外周血MDSC的比例。
　?。?）用CD3/CD28免疫磁珠法刺激培養(yǎng)正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞24h，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測刺激培養(yǎng)0h和24h后CD4+CD69+的細(xì)胞比例。
　?。?）

4、采用濃度均為10ng/ml的GM-CSF和IL-6聯(lián)合刺激培養(yǎng)正常小鼠骨髓MDSC4天，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測未刺激組與刺激組CD11b+Gr-1+MDSC的比例，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測MDSC的產(chǎn)物Arg-1和iNOS的表達(dá)水平。
　?。?）運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測CD3/CD28免疫磁珠刺激培養(yǎng)脾臟CD4+T細(xì)胞0h、6h、12h、24h四個不同時間點miR-342-3p、miR-181d、miR-122-3p、m

5、iR-9-5p的表達(dá)水平，以及GM-CSF和IL-6聯(lián)合刺激培養(yǎng)骨髓MDSC4天后，未刺激組與刺激組中這四種miRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）造模第45天時，CIA小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的比例明顯高于正常小鼠（P<0.001），CIA小鼠骨髓、脾臟、外周血MDSC的比例與正常小鼠相比也明顯升高（P均<0.001）。
　?。?）用CD3/CD28免疫磁珠法刺激培養(yǎng)正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞24h后CD4+CD

6、69+的細(xì)胞比例明顯高于培養(yǎng)0h（P<0.01）。
　　（3） miR-342-3p和miR-181d在刺激培養(yǎng)脾臟CD4+T細(xì)胞6h、12h、24h后的表達(dá)水平均明顯低于0h（P<0.05），而6h、12h、24h這三組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），miR-9-5p和miR-122-3p的表達(dá)各組間也未見明顯差異（P>0.05）。
　　（4）與未刺激組相比，使用GM-CSF和IL-6聯(lián)合刺激培養(yǎng)小鼠骨髓MDSC4天

7、后CD11b+Gr-1+MDSC的比例顯著升高（P<0.001），Arg-1的mRNA水平也明顯升高（P<0.01），iNOS的表達(dá)水平雖呈升高趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）與未刺激組相比，使用GM-CSF和IL-6聯(lián)合刺激培養(yǎng)小鼠骨髓MDSC4天后miR-342-3p的表達(dá)水平顯著下降（P<0.001），miR-9-5p的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），miR-181d和miR-122-3p的表達(dá)水平差異

8、無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?） CD4+T細(xì)胞在CIA小鼠脾臟中活化增殖，MDSC在CIA小鼠骨髓、脾臟、外周血中也明顯活化擴(kuò)增，提示CD4+T細(xì)胞和MDSC很可能在CIA小鼠的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
　?。?） CD3/CD28免疫磁珠法在體外能夠誘導(dǎo)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞活化， GM-CSF和IL-6聯(lián)合刺激法也能夠誘導(dǎo)小鼠骨髓MDSC活化擴(kuò)增。
　　（3）體外誘導(dǎo)小鼠CD4+T細(xì)胞