CD4+T細(xì)胞亞群在血吸蟲蟲卵肉芽腫形成中的作用.pdf

1、目的：
　　通過構(gòu)建日本血吸蟲病Balb/c小鼠模型，研究CD4+T細(xì)胞亞群及其Th1/Th2、Th17/Treg失衡在日本血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫形成中的作用，完善日本血吸蟲致病機(jī)制，為血吸蟲病治療提供新的靶標(biāo)。
　　方法：
　　用日本血吸蟲尾蚴感染Balb/c小鼠，構(gòu)建4w、6w、8w、10w、12w、16w、20w、24w不同時(shí)間點(diǎn)日本血吸蟲病小鼠模型，采用FCM檢測各組小鼠肝臟和脾臟中CD4+T細(xì)胞亞群中Th1、T

2、h2、Th17及Treg細(xì)胞百分比與比值變化；ELISA檢測小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β及IL-1β水平；Trizol法提取肝組織mRNA，real-time PCR檢測肝臟組織中IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt、Foxp3、TGF-β及IL-1β等分子mRNA表達(dá)水平；取小鼠肝組織切片

3、，HE和Masson染色法觀察肝臟病理變化。
　　結(jié)果：
　　小鼠肝組織切片HE染色及Masson染色觀察到感染小鼠肝組織均發(fā)生不同程度的炎癥反應(yīng)；8w時(shí)出現(xiàn)了嚴(yán)重的蟲卵肉芽腫和輕度膠原蛋白纖維沉積，第12w膠原纖維蛋白量達(dá)高峰，肝臟炎癥反應(yīng)和病變以8w～12w最為嚴(yán)重；16w后炎癥反應(yīng)開始減輕，20w～24w炎癥反應(yīng)進(jìn)一步減輕，形成大量纖維瘢痕病灶，蟲卵死亡液化形成空洞。
　　FCM結(jié)果顯示：Th1和Th2細(xì)胞的百分

4、比在感染組小鼠肝臟和脾臟顯著性高于正常對照組，P<0.05，肝臟中Th1細(xì)胞比例在血吸蟲感染第4w和16w為高峰值，分別是4.29±0.74％和4.90±0.14%，顯著性高于其它時(shí)間點(diǎn)，Th2細(xì)胞比例在血吸蟲感染第8w達(dá)高峰，為6.47±0.18%，顯著性高于其它時(shí)間點(diǎn)；在正常對照組小鼠肝臟中Th1/Th2比值為3.17%，血吸蟲感染第4w，Th1細(xì)胞百分比顯著性升高，Th1/Th2比值為5.67%；感染第6w時(shí)，Th1細(xì)胞百分比顯著

5、性下降，而Th2細(xì)胞百分比顯著性升高，此時(shí)Th1/Th2比值倒置為0.84%；在感染第8w時(shí)，Th1/Th2比值倒置為0.46%；感染10w時(shí)，Th1/Th2比值為0.47%，感染12w時(shí)，Th1/Th2比值為0.53%，而感染第16w時(shí)，Th1細(xì)胞比例顯著性升高， Th2細(xì)胞比例顯著性下降，Th1/Th2比值為1.55%，16w至24w，Th1/Th2比值均顯著性低于正常對照組，但與16w比較無顯著性差異。脾臟中Th1細(xì)胞比例在血吸蟲

6、感染第4w和16w為高峰值，分別是6.86±0.99%和6.0±0.6%，顯著性高于其它時(shí)間點(diǎn)，Th2細(xì)胞比例在血吸蟲感染第8w達(dá)高峰，為6.94±0.75%，顯著性高于其它時(shí)間點(diǎn)；在正常對照組小鼠脾臟中Th1/Th2比值為3.17%，血吸蟲感染第4w時(shí)，Th1細(xì)胞百分比顯著性升高，Th1/Th2比值為5.86%；感染第6w時(shí)，Th1細(xì)胞百分比顯著性下降，而Th2細(xì)胞百分比顯著性升高，此時(shí)Th1/Th2比值倒置為0.8%；在感染第8w時(shí)

7、，Th1/Th2比值倒置為0.54%；在感染10w時(shí)， Th1/Th2比值為0.58%，感染12w時(shí)，Th1/Th2比值為0.86%，而感染第16w時(shí)， Th1細(xì)胞比例顯著性升高，Th2細(xì)胞比例顯著性下降，Th1/Th2比值達(dá)2.34%，16w至24w，Th1/Th2比值均顯著性低于正常對照組，但與16w比較無顯著性差異。
　　Th17和Treg細(xì)胞百分比在感染組小鼠肝臟和脾臟均顯著性高于正常對照組，P<0.05，肝臟中正常小鼠的

8、IL-17A+Th17、IL-17F+Th17和Treg細(xì)胞比例分別為1.367±0.071、1.267±0.55和3.64±0.255；IL-17A+Th17和IL-17F+Th17細(xì)胞比例在血吸蟲感染第8w和16w為高峰值，分別是29.58±1.195%、27.16±1.94%和30.057±1.54%、38.88±2.7%，顯著性高于其它時(shí)間點(diǎn)；Treg細(xì)胞比例在血吸蟲感染第8w達(dá)峰值，為31.8±0.4%，顯著性高于其它時(shí)間點(diǎn)；

9、在正常對照組小鼠肝臟中Th17/Treg比值為0.72%，各感染組小鼠Th17/Treg比值均顯著性高于正常對照組，Th17細(xì)胞升高程度均顯著性高于 Treg細(xì)胞，感染第16w時(shí)， Th17/Treg比值達(dá)峰值為4.35%。脾臟中正常小鼠的IL-17A+Th17、IL-17F+Th17和Treg細(xì)胞比例分別為1.79±0.07、1.34±0.112和3.613±0.14； IL-17A+Th17和IL-17F+Th17細(xì)胞比例在血吸蟲感

10、染第8w和16w為高峰值，分別是21.07±1.12%、17.22±1.12%和28.2±1.94%、27.9±1.62%，顯著性高于其它時(shí)間點(diǎn)； Treg細(xì)胞比例在血吸蟲感染第8w達(dá)峰值，為23.04±1.21%，顯著性高于其它時(shí)間點(diǎn)；在正常對照組小鼠脾臟中Th17/Treg比值為0.86%；各感染組小鼠Th17/Treg比值均顯著性高于正常對照組，Th17細(xì)胞升高程度均顯著性高于Treg細(xì)胞，感染第16w時(shí)，Th17/Treg比值達(dá)

11、峰值為5.99%。
　　real-time PCR結(jié)果顯示：肝臟組織中IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt、Foxp3、TGF-β及IL-1β mRNA的表達(dá)量均顯著性高于正常對照組，P<0.05，其中IFN-γ和IL-12 mRNA表達(dá)量在感染4w達(dá)峰值，分別為52.52±3.13和123.9±2.48，IL-2 mRNA表達(dá)量在感染4w、16w達(dá)峰值，分別為12

12、3.9±2.48和133.6±2.95，與Th1細(xì)胞升高的時(shí)間點(diǎn)相一致；IL-4和IL-10 mRNA表達(dá)量在感染第8w達(dá)峰值，分別為140.6±5.36和12.77±1.94，與Th2細(xì)胞升高的時(shí)間點(diǎn)相一致；IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt mRNA表達(dá)量在感染第8w達(dá)峰值，分別為84.05±5.6、57.01±4.68、757.6±2.45和157.14±2.4，與Th17細(xì)胞升高的時(shí)間點(diǎn)相一致，F(xiàn)oxp3和TGF-β

13、mRNA表達(dá)量在感染第8w達(dá)峰值，分別為87.88±8.25和1451.1±7.4，與Treg細(xì)胞升高的時(shí)間點(diǎn)相一致；IL-1βmRNA表達(dá)量在感染8w、16w達(dá)峰值，分別為38.05±4.82和23.7±4.82。
　　ELISA檢測結(jié)果顯示：小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、TGF-β、及IL-1β的表達(dá)量均顯著性高于正常對照組，P<0.05，其中IL-2、IFN-γ含量在感

14、染第4w、16w達(dá)峰值，分別為87.77±1.58、35.97±0.8和59.8±1.45、30.32±0.86；IL-4、IL-10含量在感染第8w達(dá)峰值，分別為58.8±0.41和189.4±3.46；IL-6、IL-23含量在感染第8w達(dá)峰值，分別為976.7±1.53和95.85±6.84；IL-17含量在感染第8w、16w達(dá)峰值，分別為174.47±0.2和161.4±0.43；TGF-β含量在感染第8w達(dá)峰值，其值為1212

15、.8±0.5；IL-1β含量在感染第10w、16w達(dá)峰值，分別為43.33±0.96和32.33±0.86；ELISA檢測結(jié)果與real-time PCR結(jié)果相吻合。
　　結(jié)論:
　　小鼠感染日本血吸蟲后，隨著肝臟病理損傷程度的增加，Th2、Th17及Treg細(xì)胞百分比及相關(guān)細(xì)胞因子顯著性升高，導(dǎo)致Th1/Th2及Th17/Treg細(xì)胞比例嚴(yán)重失衡，Th2與Th17增高程度與肝蟲卵肉芽腫病變嚴(yán)重程度相一致，說明Th2和Th1