TLRs在日本血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫形成中的作用與機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)構(gòu)建日本血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫模型，體內(nèi)研究TLRs分子的表達(dá)及與血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫炎性病變的關(guān)系；用SjSEA和SjSWA作為TLRs的PAMPs，體外研究血吸蟲抗原對(duì)TLRs途徑的激活及誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
　　方法：
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建日本血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫Balb/c小鼠模型，F(xiàn)CM和real-time PCR分別檢測(cè)感染不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肝組織中TLR2、TLR4蛋白及mRNA表

2、達(dá)水平，肝臟組織切片HE、Masson染色觀察肝組織病理變化；ELISA檢測(cè)血清中前炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）的表達(dá)，速率法檢測(cè)ALT/AST變化。
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：制備SjSEA和SjSWA，分離純化與培養(yǎng)pMφ，分別用SjSEA、SjSWA、LPS及PBS在不同時(shí)間點(diǎn)刺激pMφ，ELISA檢測(cè)前炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平，real-time PCR檢測(cè)TLR2、TLR4mRNA

3、，western blot檢測(cè)pMφ總蛋白中κB抑制蛋白（IκB），觀察NF-κB活化情況。
　　結(jié)果：
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：肝組織切片HE染色及Masson染色觀察到肝肉芽腫面積及肝臟膠原沉積隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而增加；感染組（2w、4w、6w、8w）與正常對(duì)照組（0w）比較，F(xiàn)CM結(jié)果顯示感染組小鼠肝臟組織TLR2和TLR4表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組，P<0.05，感染8w達(dá)峰值（TLR2:95.44±10.35％，TLR4

4、:39.27±3.88%）；real-time PCR結(jié)果顯示TLR2和TLR4表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），感染8w達(dá)峰值（TLR2:7.14±0.96，TLR4:5.97±0.13）；ELISA結(jié)果表明，前炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α和 IL-6）水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），IL-1β含量在感染6w達(dá)峰值(234.81±31.7pg/mL)，TNF-α含量在感染4w達(dá)峰值(977.1±45.80pg/

5、mL)，IL-6含量在感染8w時(shí)達(dá)峰值(136.00±14.20pg/mL)；血清ALT和AST值顯著高于正常對(duì)照組，感染8w達(dá)峰值（ALT:149.60±15.30U/L，AST:163.50±21.80U/L）（P<0.05）；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TLR2和TLR4水平與肝蟲卵肉芽腫炎癥程度、前炎癥細(xì)胞因子（IL-1β和IL-6）表達(dá)和肝臟損傷指標(biāo)（ALT和AST）呈密切正相關(guān)性。
　?。?）體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SjSEA、SjSW

6、A在不同時(shí)間點(diǎn)（0h、6h、12h、24h）能誘導(dǎo)pMφ產(chǎn)生IL-1β、TNF-α和IL-6，與對(duì)照組（PBS）比較有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），當(dāng)刺激12h時(shí)CKs達(dá)高峰，SjSEA刺激后IL-1β、TNF-α和IL-6峰值分別為91.90±15.28pg/mL、1350.90±160.28pg/mL和52.71±13.38pg/mL；SjSWA刺激后IL-1β、TNF-α和IL-6峰值分別為107.03±25.19p

7、g/mL，983.43±18.19pg/mL和48.03±11.19pg/mL；real-time PCR結(jié)果顯示，TLR4 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較有顯著差異（P<0.01），刺激12h達(dá)高峰，SEA刺激后其mRNA含量達(dá)10.91±1.32，SWA刺激組為10.14±1.23，TLR2 mRNA在血吸蟲抗原刺激組和正常對(duì)照組比較無(wú)顯著變化（P>0.05）；western blot結(jié)果顯示，SjSEA及SjSWA刺激pMφ30min

8、后IκB水平顯著降解，但作用60min后，IκB水平略有升高。
　　結(jié)論:
　?。?）TLR2和TLR4分子的表達(dá)量與前炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α及IL-6）的分泌、肝受損程度（ALT和AST）和血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫炎性病變程度呈正相關(guān)，說(shuō)明TLR2和TLR4途徑可能參與了血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫的形成。
　?。?）SjSEA和SjSWA可能作為TLR4 PAMPs，激活TLR4信號(hào)途徑，分泌IL-1β、TNF-