粉紅螺旋聚孢霉67-1生防相關(guān)基因的克隆與功能驗證.pdf

1、粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea，異名：粉紅粘帚霉，Gliocladium roseum）是一類重要的菌寄生菌，能夠侵染核盤菌、絲核菌、鐮刀菌和灰葡萄孢等多種植物病原真菌，具有巨大的生防潛力，但目前對粉紅螺旋聚孢霉生防相關(guān)基因的研究還比較少。本研究從實驗室前期構(gòu)建的高效菌株67-1寄生核盤菌轉(zhuǎn)錄組中選取差異表達基因，進行熒光定量PCR驗證。對篩選出的轉(zhuǎn)醛醇酶基因Tal67、單加氧酶基因Mon67和α-半乳糖苷酶基因A

2、ga67進行生物信息學(xué)分析，通過基因敲除和回補研究其功能。
　　根據(jù)67-1寄生轉(zhuǎn)錄組分析，選取17個差異表達基因，以延伸因子EF1為內(nèi)參進行實時熒光定量PCR驗證。結(jié)果表明，各基因表達水平與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。在菌核誘導(dǎo)過程中（0-48 h），Unigene4498和Unigene8262表達量升高，在24 h達到最大值，分別為沒有菌核處理的13.9倍和32.3倍。Unigene13246在前期表達量有所降低，但48 h時，

3、表達量顯著提高，是對照的7.4倍，表明這三個基因可能參與了粉紅螺旋聚孢霉菌寄生過程。
　　從67-1全基因組獲得Unigene4498、Unigene8262和Unigene13246基因全長。生物信息學(xué)分析表明，Unigene4498的開放閱讀框（ORF）為750 bp，編碼249 AA，與膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的轉(zhuǎn)醛醇酶同源性為77％，命名為Tal67。Unigene8262

4、的ORF為1266 bp，編碼421 AA，與蝗綠僵菌Metarhizium acridum的單加氧酶同源性為49%，命名為Mon67。Unigene13246的ORF為1668 bp，編碼555 AA，與間座殼屬Diaporthe ampelina的α-半乳糖苷酶的同源性52%，命名為Aga67。
　　利用同源重組原理構(gòu)建了Tal67、Mon67和Aga67的敲除載體，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，分別獲得2株 Tal67

5、敲除突變株ΔTal67-1和ΔTal67-8、3株 Mon67敲除突變株ΔMon67-22、ΔMon67-26和ΔMon67-28，以及2株Aga67敲除突變株ΔAga67-30和ΔAga67-62。根據(jù)Tal67基因全長序列，構(gòu)建了Tal67回補載體，并成功得到5株ΔTal67-8的回補菌株。
　　對67-1轉(zhuǎn)化子進行生物學(xué)特性分析，結(jié)果表明，敲除突變株ΔTal67的生長速率顯著低于野生菌株（WT，P<0.05），對番茄灰霉病菌

6、的拮抗能力和對核盤菌菌核的寄生能力比WT分別降低了15.8%和24.6%。溫室試驗表明，67-1對大豆菌核病和黃瓜枯萎病的防效分別為65.3%和75.6%，而ΔTal67僅為17.8%和23.1%；回補菌株?Tal67+的防效與WT一致。ΔMon67和ΔAga67的生長速率、產(chǎn)孢水平，以及對番茄灰霉病菌的拮抗能力與WT沒有顯著差異，但是對菌核的寄生能力分別降低了34.2%和28.7%，對黃瓜枯萎病的防效比WT分別降低了51.5%和41.