粉紅粘帚霉67-1菌株對(duì)核盤菌的寄生性及其分子機(jī)理.pdf

1、粘帚霉(Gliocladiumspp.)是一類分布廣泛的土壤習(xí)居菌，也是目前已知頗具應(yīng)用前景的植病生防因子之一。粉紅粘帚霉(G.roseum)67-1菌株(后文中簡(jiǎn)稱GR67-1)是中國農(nóng)科院植?！嫱羵鞑『?shí)驗(yàn)室從海南省樂東縣分離篩選而獲得的一株高效植病生防菌株，其對(duì)多種植物病原菌都具有很強(qiáng)的寄生致病能力。本論文工作探討了GR67-1菌株寄生核盤菌菌核寄生致病作用，并研究在該寄生過程中的關(guān)鍵酶——葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)和有關(guān)特性，揭示其與病原菌

2、間的互作機(jī)理，為GR67-1菌株的改良及構(gòu)建其基因工程菌株奠定基礎(chǔ)。 用平板培養(yǎng)基對(duì)峙法培養(yǎng)測(cè)定GR67-1菌株對(duì)核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)菌落生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果表明GR67-1菌株對(duì)核盤菌菌絲和菌落的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。GR67-1菌株的孢子液(108個(gè)/ml)處理菌核30min，濾紙上保濕培養(yǎng)一周后菌核全部腐爛失活。同樣孢子液處理后的菌核在PDA平板上培養(yǎng)4-7天，菌核沒有萌發(fā)，解剖鏡下僅看

3、到GR67-1的菌絲和孢子。說明GR67-1菌株對(duì)核盤菌的作用主要是破壞其菌核，同時(shí)對(duì)核盤菌菌絲的生長(zhǎng)也有抑制作用。 用GR67-1菌株的孢子液浸泡菌核后，保濕培養(yǎng)，連續(xù)測(cè)定幾種重要水解酶(幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、纖維素酶及蛋白酶)的活性，結(jié)果顯示葡聚糖酶活性顯著且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)活性明顯變化，其中第7天酶活最高；而幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和纖維素酶等其它酶的活性很低或未檢測(cè)得到。由此推測(cè)，葡聚糖酶參與GR67-1菌株寄生核盤菌菌核過程并在

4、其中可能起重要作用。 利用牛津杯法測(cè)定經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、SephadexG-25凝膠過濾脫鹽、超濾濃縮多步處理后的GR67-1酶液對(duì)水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniAG-1.1a)、棉苗立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporium)、小麥根腐病菌(DrechsleraSoFokiniana)、番茄灰霉病菌

5、(Botrytiscinnerea)、大豆核盤病菌(Sclerotiniasclerotium)和茄腐鐮刀病菌(Fusariumsolani)的抑制作用。結(jié)果表明8種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，出現(xiàn)較明顯的抑菌帶。其中GR67-1粗提酶液對(duì)大豆核盤病菌、水稻紋枯病菌、棉苗立枯病菌及番茄灰霉病菌的抑制效果較明顯。 將上述GR67-1的提液通過進(jìn)一步非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后做活性染色(TTC法)，獲得一條亮紅色帶，即

6、為葡聚糖酶活性帶?；厥赵摶钚詭е械拿赋煞郑?jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)其為單一條帶，將該葡聚糖酶定名為GrGLU1，根據(jù)該酶帶和標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)帶的位置進(jìn)行比較，確定此酶蛋白的分子量大約為75kDa。采用PVDF膜通過半干濕法轉(zhuǎn)膜，經(jīng)Edman降解法測(cè)序發(fā)現(xiàn)該酶為一N-端封閉的蛋白質(zhì)。 將SDS-PAGE電泳凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R-250染色，經(jīng)胰蛋白酶酶切，通過鈉升電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF2)技術(shù)得到

7、葡聚糖酶GrGLU1的肽質(zhì)量指紋圖譜，進(jìn)一步利用ESI-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)，隨機(jī)選擇m/s值分別為622.82、707.34、742.34、1068.02的4個(gè)肽段進(jìn)行ESI-MS/MS分析，測(cè)得它們的氨基酸序列分別為GSQLWDVHFR，VPFGSSAPQPGLTR，EVYDKLLNYNGR和RQPGDVGNVELSDFLMETK。根據(jù)氨基酸測(cè)序結(jié)果，查詢Mascot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)其有4個(gè)葡聚糖酶登陸號(hào)(Gi/

8、57232537、Gi/16588810、Gi/7547014和Gi/8886891，它們分別來源于枝頂孢屬Acremonium、小麥白粉菌Blumeriagraminis、小盾殼霉Coniothyriumminitans和深綠木霉Trichodermaatroviride)與這里的葡聚糖酶部分相匹配，其中與Gi/57232537和Gi/8886891均有兩個(gè)肽段相匹配，而與另外兩個(gè)葡聚糖酶蛋白質(zhì)有一個(gè)匹配肽段。根據(jù)本研究結(jié)果及其與蛋白