冬蟲夏草粉紅菌株的分子鑒定.pdf

1、冬蟲夏草（Cordyceps Sinensis（Berk）Sacc）是蟲草菌感染鱗翅目蝙蝠蛾科（Hepialus armoricanus Oberthur）幼蟲后發(fā)育成的真菌子座和充滿菌絲的僵死幼蟲的復(fù)合體，是一種名貴中藥材。近年來的環(huán)境惡化及冬蟲夏草采挖過度，使冬蟲夏草野生資源瀕臨枯竭。
　　研究表明冬蟲夏草菌絲體的成份與天然冬蟲夏草非常相似，是天然冬蟲夏草最適替代品。研究小瓶靜止培養(yǎng)菌絲體生長(zhǎng)過程中粉紅菌株ZH-1出現(xiàn)的原因和

2、機(jī)理對(duì)提高冬蟲夏草菌絲體菌絲得率和開發(fā)新的冬蟲夏草菌絲體產(chǎn)品具有重要意義。本論文從4個(gè)方面對(duì)冬蟲夏草菌株SH-1轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t菌株ZH-1出現(xiàn)的原因和機(jī)理進(jìn)行了試驗(yàn)研究，主要結(jié)果如下：
　　1.冬蟲夏草真菌培養(yǎng)過程中，菌株SH-1的菌絲會(huì)出現(xiàn)粉紅色變化的現(xiàn)象，并且菌株SH-1和粉紅菌株ZH-1在形態(tài)上存在很大差異，菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1的ITS序列比對(duì)鑒定中發(fā)現(xiàn)，11株SH-1和兩株ZH-1都能擴(kuò)增出條帶，條帶清晰且穩(wěn)定，分布

3、在500-750bp范圍內(nèi)，13株菌株在Genbank中應(yīng)用Blast比對(duì)都與Paecilomyces sp. Cs-4（EU328187）的相似性達(dá)到了100％，用三種方法對(duì)13株菌株ITS序列與分離自冬蟲夏草的32株真菌ITS序列（下載自Genbank）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，三種方法都顯示13株菌與蝙蝠蛾擬青霉歸為一支，可以確定培養(yǎng)的這13株菌株為同一個(gè)種，既蝙蝠蛾擬青霉。
　　2.比較了冬蟲夏草菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1中活性

4、成分及五種核苷成分的含量。結(jié)果表明：粉紅菌株ZH-1的各項(xiàng)組分指標(biāo)都位于菌株SH-1含量范圍之內(nèi)，蟲草酸含量高于菌株SH-1。
　　3.考察培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH、裝液量以及光照條件5個(gè)環(huán)境因素對(duì)菌株SH-1產(chǎn)生粉紅菌株 ZH-1的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選出四個(gè)關(guān)鍵因素，通過響應(yīng)面法中的BBD設(shè)計(jì)優(yōu)化冬蟲夏草真菌的培養(yǎng)環(huán)境，分析粉紅菌株ZH-1出現(xiàn)的關(guān)鍵影響因素。結(jié)果表明產(chǎn)生粉紅變化的最適的配方條件為:培養(yǎng)時(shí)間（x1）為8

5、0d、培養(yǎng)溫度（x2）為20.55℃、pH值（x3）為7.51、裝液量（x4）為250mL，在此培養(yǎng)基配方條件下，粉紅菌株ZH-1產(chǎn)生概率為35.14%；得出了ZH-1的最大得率培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間（x1）為80d、培養(yǎng)溫度（x2）為22.25℃、pH值（x3）為6.89、裝液量（x4）為250mL，在此培養(yǎng)基配方條件下，粉紅菌株ZH-1得率為8.95%。
　　4.配方條件是菌株產(chǎn)生變化的重要決定因素。在響應(yīng)面法測(cè)定粉紅菌株ZH-1

6、出現(xiàn)概率的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生ZH-1最適的培養(yǎng)基配方為氮源A（x1）為43.51mL，K2HPO4（x2）為0.6g、氮源B（x3）為2.56g、葡萄糖（x4）5.18g。在此培養(yǎng)基配方條件下，菌株ZH-1產(chǎn)生概率為37.24%。培養(yǎng)基配方中氮源A、K2HPO4的含量對(duì)產(chǎn)生粉紅現(xiàn)象有顯著影響，氮源A、葡萄糖含量對(duì)粉紅菌株ZH-1的得率有顯著影響。
　　5.綜上所述，菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1在分子水平上是同一個(gè)物種，而在形態(tài)和成