重組hGM-CSF乳酸鏈球菌對TNBS誘導的大鼠腸損傷的保護作用.pdf

1、研究背景 腸道損傷與腸粘膜屏障功能改變密切相關，特別是腸粘膜生物屏障及免疫屏障日漸受到重視。炎癥性腸病(Inflammatory Bowl Desease,IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)的發(fā)病與遺傳背景、免疫調節(jié)失控和個體差異以及環(huán)境因素等多方面原因有關，但最終表現為腸粘膜對腸道微生物抗原免疫反應失常而導致腸粘膜損傷和破壞。資料顯示，IBD

2、發(fā)病率逐年增高，已成為嚴重影響患者生活質量的常見疾病。IBD的傳統(tǒng)治療主要是針對腸道微生物感染和免疫系統(tǒng)的激活，以非特異性抗炎藥物和免疫抑制劑為主，并輔以抗菌藥物。臨床觀察發(fā)現，上述療法存在明顯的藥物毒性反應和全身性副作用，特別是針對頑固性CD的治療仍缺乏有效的措施，不能改變CD的自然病程。近年來的研究表明，CD的生物是調整各種炎癥因子水平的有效方法，但確切療效及生物安生性尚待關注。 新近研究顯示，CD發(fā)生的機制可能與腸道先天免

3、疫反應缺陷以及中性粒細胞、巨噬細胞功能受損有關；重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重組人粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)可通過增強中性粒細胞的趨化性、單核巨噬細胞的功能而調節(jié)腸道自然免疫狀態(tài)，從而對CD的治療發(fā)揮作用。目前臨床應用或研究的重組hGM-CSF主要是把編碼hGM-CSF的cDNA與相應表達載體構建重組質粒并轉化于大腸桿菌、酵母菌、減毒沙門氏菌及腺病毒等得來，用藥途徑為經皮下注射，存在一些全身毒副作用

4、。 腸道粘膜免疫及系統(tǒng)免疫可由不同組群的腸道共生菌(Commensal bacteria)調節(jié)。乳酸鏈鏈菌(Streptococcus lactis；Lactococcus lactis)為腸道共生菌，屬于相對安全菌株(generally regard as safe，GRAS)，它可改善胃腸微生態(tài)平衡，抑制腸道致病菌粘附及腸粘膜對細菌易位的易感性而加強腸粘膜屏障功能。由于該菌具有不產生內毒素而且產生的蛋白酶遠少于大腸桿菌等優(yōu)點

5、，同時經改造后的乳鏈菌耐酸、耐膽汁，因而被大量用于表達多種生物多肽或蛋白。近來，SteidlerLetal，Vandenbrotlcke K etal相繼成功構建了能經口服投遞到腸道分泌表達有活性的hIL-10、hTFF蛋白的重組乳鏈菌并用于實驗性結腸炎的治療，取得了一定的療效。目前國內外尚無重組hGM-CSF乳酸鏈球菌的報道。目的及意義構建能在腸道直接分泌表達hGM-CSF活性的重組乳酸鏈球菌，經口服用于克羅恩病動物模型的治療，以期為

6、克羅恩病的治療提供更理想的途徑。重組hGM-CSF乳酸鏈球菌可以同時發(fā)揮hGM-CSF和乳酸鏈球菌的腸粘膜保護作用，并具有可在局部表達活性、無抗原性、使用安全、服用方便、便于大規(guī)模生產等優(yōu)點，可能發(fā)揮更佳的治療作用。主要內容及方法、結果本課題中，參照GenBank公布的序列，設計及構建乳鏈菌分泌型表達系統(tǒng)；采用了基因拼裝(PCR based gene assembly，PBGA)及基因克隆(gene cloning)技術優(yōu)化了hGM-C

7、SF的基因編碼，并體外合成了hGM-CSF cDNA；構建了hGM-CSF乳酸鏈球菌表達載體pTRCSF；獲得表達。hGM-CSF的重組乳鏈菌LL-CSF；為驗證hGM-CSF的重組乳鏈菌能否在腸道定植并分泌表達，同時又構建了其帶綠色熒光的表達載體pTRCSFGFP及重組菌LL-CSFGFP；通過體外細胞試驗檢測了重組hGM-CSF。乳酸鏈球菌中hGM-CSF的蛋白表達及其活性；最后經動物試驗評價其對TNBS誘導的大鼠結腸損傷(發(fā)病機制

8、及病理改變類似人類CD)，的保護作用。 結論 1成功拼接了hGM-CSFcDNA及乳酸鏈球菌分泌型表達系統(tǒng)基因PUS。 2成功構建了乳酸鏈球菌分泌型表達系統(tǒng)pPUS。 3成功構建了重組hGM-CSF乳酸鏈球菌的克隆載體pPUSCSF、pPUSCSFGFP，表達載體pTRCSF及其驗證載體pTRCSFGFP。 4成功構建了重組hGM-CSF乳酸鏈球菌LL-CSF。 5重組hGM-CSF乳酸鏈