重癥肌無(wú)力患者胸腺組織共刺激分子B7-H1-B7-DC—PD-1表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景及目的：重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)是主要累及神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor,AChR),主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody,AChRab)介導(dǎo)、細(xì)胞免疫(cell-mediated immunity,CMI)依賴、補(bǔ)體參與的自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。大量文獻(xiàn)證實(shí)

2、MG患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群異常,經(jīng)AChR刺激后細(xì)胞因子的產(chǎn)生也有異常變化,這些結(jié)果表明MG患者存在細(xì)胞免疫和體液免疫的異常。同時(shí),由于70％-80%MG患者胸腺異常(包括胸腺增生和胸腺瘤),而且胸腺切除術(shù)是有效治療MG的手段之一,因而MG與胸腺異常有關(guān)成為共識(shí)?？乖禺愋訲細(xì)胞的活化需要兩個(gè)不同的信號(hào)。其中,第一信號(hào)來(lái)自抗原肽—MHC(major histocompatibility complex,主要組織相容性復(fù)合體)分子組成的

3、復(fù)合物與TCR(T cell receptor,T細(xì)胞受體)的相互作用;第二信號(hào)由抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC)表面表達(dá)的共刺激分子傳遞給T細(xì)胞。近十幾年的研究表明,共刺激信號(hào)可促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,以及為防止T細(xì)胞發(fā)生凋亡提供生存信號(hào)。更重要的是,由于共刺激信號(hào)可以成為增強(qiáng)或終止免疫應(yīng)答的一種手段,因而已日益受到關(guān)注。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的共刺激途徑B7-H1/B7-DC-PD-1對(duì)已

4、經(jīng)活化的效應(yīng)性T細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用。B7-H1因?yàn)槟軌蛲ㄟ^(guò)與T細(xì)胞表面不同的特異性受體結(jié)合調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和激活作用,因而成為新近研究熱點(diǎn)。一方面,B7-H1可以在抗CD3抗體或異種抗原刺激下與相應(yīng)的配體PD-1結(jié)合促進(jìn)人T細(xì)胞增殖和促進(jìn)IL-10分泌。另一方面,如用B7-H1刺激T細(xì)胞,可抑制TCR介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN—γ的產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞周期停止。B7-H1在這種T細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作

5、用。本研究利用免疫組化、分子生物學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)等實(shí)驗(yàn)手段,對(duì)MG患者胸腺組織進(jìn)行B7-H1表達(dá)的檢測(cè),并檢測(cè)B7-H1/B7-DC-PD-1共刺激信號(hào)通路分子的表達(dá)處于異常狀態(tài),提示異常的共刺激信號(hào)與MG密切相關(guān)。研究B7-H1/B7-DC-PD-1共刺激信號(hào)通路對(duì)MG患者細(xì)胞免疫的調(diào)控作用,探討該信號(hào)傳導(dǎo)通路在MG發(fā)生中的作用,可為診斷、預(yù)防和治療MG提供依據(jù)。
　　方法：無(wú)菌取臨床確診的

6、21例重癥肌無(wú)力(MG)患者和10例先天性心臟病患者切除的胸腺組織,分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1.制作冰凍切片,免疫組化方法檢測(cè)胸腺組織中B7-H1分子的表達(dá);2.提取胸腺組織總RNA,RT-PCR分別擴(kuò)增B7-H1、B7-DC、PD-1和內(nèi)參β-actin基因,1.2%瓊脂糖凝膠電泳,利用Quantity One(?)4.6.3凝膠圖像分析軟件,測(cè)定B7-H1、B7-DC、PD-1和內(nèi)參β-actin基因電泳條帶灰度值,計(jì)算B7-H1、B7-

7、DC、PD-1基因條帶灰度值與相應(yīng)標(biāo)本β-actin基因條帶灰度值的比值,作為該例標(biāo)本目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.0,比較目的基因在MG患者和正常對(duì)照胸腺組織的表達(dá)情況;3.機(jī)械分離胸腺細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胸腺細(xì)胞表面B7-H1分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.免疫組化結(jié)果顯示:MG組與正常組相比較B7-H1蛋白表達(dá)明顯減少,表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ~2=4.19,p<0.05)。2.采用成組資料t

8、檢驗(yàn),MG組(n=21)B7-H1mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.394±0.258,和對(duì)照組(n=10,0.144±0.144)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MG組(n=21)B7-DCmRNA表達(dá)水平為0.710±0.080,和對(duì)照組(n=10,0.647±0.058)相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。3.成組設(shè)計(jì)兩樣本t檢驗(yàn)比較,MG患者中不同病理分型的B7-H1 mRNA和B7-DC mRNA的表達(dá)水平之間差異無(wú)明顯統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義。其中增生型和萎縮型之間兩者p值分別為0.057和0.822,按照檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明,MG組和對(duì)照組胸腺細(xì)胞表面均表達(dá)B7-H1分子,與正常對(duì)照組胸腺細(xì)胞B7-H1分子表達(dá)陽(yáng)性率(n=11,33.48±2.05)相比較,伴胸腺瘤MG組B7-H1分子表達(dá)(n=2,40.09±1.98)顯著增高,胸腺萎縮組(n=5,32.17±1.79)則變化不大,而增生型MG組B7-H1分子的表