重癥肌無力胸腺組織相關蛋白鑒定研究.pdf

1、目的 初步建立MG胸腺組織蛋白質(zhì)組學研究方法，獲得雙向電泳凝膠圖譜，篩選出胸腺組織重癥肌無力相關蛋白，并對其作出鑒定。從而尋找MG發(fā)病新線索，幫助臨床診斷和治療。 方法 (1)提取3例MG患者增生型胸腺組織蛋白，以7cmpH3-10IPG膠條做第一向IEF，12％SDS-PAGE垂直電泳為第二向，分析二維電泳系統(tǒng)的重復性；以17cmpH3-10IPG膠條做第一向IEF，評價分別由樣品裂解液Ⅰ和Ⅱ組成的兩種不同胸腺

2、組織蛋白提取方法。通過對這些實驗條件的優(yōu)化，獲得MG增生型胸腺組織蛋白雙向電泳凝膠圖譜。 (2)分別利用異體MG患者血清、正常人血清和自身免疫病患者血清為第一抗體，與電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的蛋白點孵育，做WesternBlotting試驗，在2-DE參考凝膠上挖取MG組特異顯色點所對應的蛋白質(zhì)點，經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶切，對所得多肽混合物進行MALDI-TOF-MS分析，得到PMF數(shù)據(jù)，登陸http：//prospector.ucs

3、f.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm網(wǎng)站，用MSFit程序在NCBInr.10.13.2004數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定蛋白質(zhì)。 結(jié)果 (1)采用樣品裂解液Ⅰ提取胸腺組織蛋白質(zhì)，使用PDQuest7.1.1軟件對不同時間獲得的銀染凝膠圖譜中相同的蛋白點進行匹配，能夠匹配的蛋白點為497個，匹配率為82.1％； (2)采用樣品裂解液Ⅰ一步法提取胸腺組織蛋白質(zhì)得到考凝膠圖像有蛋白質(zhì)點326個，而分別采用樣品裂

4、解液Ⅱ和Ⅰ的兩步法則可檢測到562個蛋白點； (3)三份樣品共12幅凝膠圖像的對比，共獲得明顯存在于各個凝膠的三個標志蛋白點，分子量和等電點分別為：A點82.7KD7.0、B點50.7KD5.76和C點33.3KD5.02； (4)WesternBlotting試驗共獲得5個MG特異顯色點，編號為2、4、6、7、9； (5)經(jīng)質(zhì)譜分析得到5個蛋白質(zhì)PMF圖譜，數(shù)據(jù)庫檢索這些蛋白分別為：2號蛋白點isopeptid

5、aseT、4號蛋白點importinbetasubunit和6號蛋白點SOULprotein。7號和9號蛋白點未能得到確認，需要更換檢索條件或進行蛋白質(zhì)測序才能進一步認定。 結(jié)論 (1)建立了MG胸腺組織蛋白質(zhì)提取的方法。采用由樣品裂解液Ⅰ和Ⅱ組成的兩步法提取胸腺組織蛋白質(zhì)可以獲得更為完整的MG胸腺組織蛋白2-DE圖像。 (2)通過對試驗條件的優(yōu)化處理，獲得MG胸腺組織蛋白雙向電泳凝膠圖像，初步建立了MG胸腺組織