中國西部地區(qū)WNV感染初步流行病學(xué)研究以及WNV和NiV主要蛋白的免疫信息學(xué)分析.pdf

1、目的： 調(diào)查西尼羅病毒（West nile virus，WNV）在中國西部地區(qū)人和動(dòng)物中的自然感染及流行情況，以獲得我國西部地區(qū)WNV的流行病學(xué)資料，評(píng)估我國西部地區(qū)的生物安全現(xiàn)狀。預(yù)測(cè)WNV和Nipah病毒（Nipah virus，NiV）主要蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位，為WNV和NiV的免疫預(yù)防和免疫治療提供理論依據(jù)。 方法： 1.對(duì)課題組前期開發(fā)的WNV一步法實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行活病毒驗(yàn)證。提取WN

2、V、登革熱病毒（dengue virus，DENV）、日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）細(xì)胞培養(yǎng)液上清和WNV接種鼠腦組織的RNA。對(duì)WNV細(xì)胞培養(yǎng)液上清所提的RNA倍比稀釋，然后進(jìn)行一步法Real time RT-PCR反應(yīng)。對(duì)WNV接種的鼠腦組織提取的RNA倍比稀釋，并進(jìn)行一步法Real time RT-PCR反應(yīng)。對(duì)DEN、JEV細(xì)胞培養(yǎng)液提取RNA，進(jìn)行一步法real time R

3、T-PCR反應(yīng)。 2.自2007年5月起，收集重慶地區(qū)發(fā)熱患者外周血標(biāo)本100份并采集重慶地區(qū)飼養(yǎng)的豬外周血標(biāo)本300份，使用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。收集重慶地區(qū)病毒性腦炎患者腦脊液22份，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。用已建立的WNV一步法實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)RNA樣本進(jìn)行WNV檢測(cè)，并提交流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告。 3.自2007年6月起，采集新疆地區(qū)驢外周血標(biāo)本

4、200份，使用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。用已建立的WNV一步法實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)RNA樣本進(jìn)行WNV檢測(cè)，并提交流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告。 4.自2008年6月起，采集寧夏地區(qū)羊外周血標(biāo)本200份和牛外周血標(biāo)本100份，使用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。用已建立的WNV一步法實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)RNA樣本進(jìn)行WNV檢測(cè)，并提交流行病

5、學(xué)調(diào)查報(bào)告。 5.根據(jù)WNV的E蛋白基因組序列，采用Garnier-Robson方案、Chou-Fasman方案和Karplus-Schulz方案預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用Kyte-Doolittle親水性方案、Emini表面可及性方案和Jameson-Wolf抗原指數(shù)方案，輔以對(duì)E蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域的分析，預(yù)測(cè)WNV的E蛋白的B細(xì)胞表位。 6.根據(jù)NiV的G蛋白和F蛋白基因組序列，采用Garnier-Robso

6、n方案、Chou-Fasman方案和Karplus-Schulz方案預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用Kyte-Doolittle親水性方案、Emini表面可及性方案和Jameson-Wolf抗原指數(shù)方案，輔以對(duì)G蛋白和F蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域的分析，預(yù)測(cè)NiV的G蛋白和F蛋白的B細(xì)胞表位。 結(jié)果： 1. WNV一步法實(shí)時(shí)RT-PCR方法能檢測(cè)的WNV細(xì)胞培養(yǎng)液上清RNA的濃度范圍為103～10-2 PFU/ml，能檢測(cè)的W

7、NV接種鼠腦組織RNA的濃度范圍為10-3～10-10（原液起始濃度100）。該方法檢測(cè)DEN、JEV細(xì)胞培養(yǎng)液上清RNA結(jié)果為陰性。 2.對(duì)重慶地區(qū)收集的人血、腦脊液和采集的豬血樣本進(jìn)行WNV核酸檢測(cè)，成功進(jìn)行了一步法實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)，所有樣本熒光擴(kuò)增曲線均無Takeoff點(diǎn)，曲線平坦，判為陰性結(jié)果。 3.對(duì)新疆地區(qū)采集的驢血樣本進(jìn)行WNV核酸檢測(cè)，成功進(jìn)行了一步法實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)，所有樣本熒光擴(kuò)增曲線均無Ta

8、keoff點(diǎn)，曲線平坦，判為陰性結(jié)果。 4.對(duì)寧夏采集的羊血和牛血樣本進(jìn)行WNV核酸檢測(cè)，成功進(jìn)行了一步法實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)，所有樣本熒光擴(kuò)增曲線均無Takeoff點(diǎn)，曲線平坦，判為陰性結(jié)果。 5. WNV的E蛋白N端第41-56，68-73，129-139，209，214-220，239-250，261-267，285-296，365-371，412-416，468和471-472區(qū)域形成α螺旋可能大；N端第32-3

9、4，61-65，140-143，157-159，166-170，185-189，201-207，210-213，301-304，322-328，238-344，354-358，406-411，434-436，442-447，450-453，460-463和482-496區(qū)域形成β折疊的可能大；E蛋白的柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域位于N端第8，15-17，27，36-38，100-101，103-104，109-112，145-147，152-155，1

10、73，175，181，192-195，226-230，257，276-277，298-299，317-320，334-335，377-381，389，399-401，430-432和439區(qū)段。綜合分析推測(cè)WNV的E蛋白B細(xì)胞表位最有可能位于N端第35-42，147-156，191-198，226-249，329-337和375-382區(qū)段，另外E蛋白N端第275-284，313-320和396-403區(qū)段也可能存在B細(xì)胞表位。

11、 6. Nipah病毒G蛋白N端第2-6區(qū)域形成α螺旋可能大；N端第24-26，47-73，80-84，87-95，110-112，117-120，178-182，200-210，215-219，229-231，245-256，264-269，279-285，290-301，362-374，384-386，398-401，406-409，427-430，435-436，450-456，462-472，483-485，511-517，51

12、9-526，560-567，573-581，586-589，592-596和600-602區(qū)域形成β折疊的可能大；G蛋白的柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域位于N端第13-19，76-78，106-107，140-146，151-153，162-165，174-175，185-186，194，227，240-243，257，259-260，275-277，288，309-312，324-329，343-346，352-354，379-382，390-394，

13、402-404，419-421，423-424，432-434，440-441，481-482，488-490，494-500，527-530，541-543，555-558和582-585區(qū)段。綜合分析推測(cè)Nipah病毒G蛋白的B細(xì)胞表位最有可能位于N端第140-153，270-278和401-408區(qū)段，另外G蛋白N端第7-23，72-79，162-175，192-198，255-262，340-348，373-394，416-42

14、4，432-448，479-489，527-534，540-547和552-561區(qū)段也可能存在B細(xì)胞表位。 Nipah病毒F蛋白N端第92-96，108-111，122-127，131-139，157-165，194-203，251，352，355，467-469和474-479區(qū)域形成α螺旋可能大；N端第1-4，11-19，37-41，44-47，57-60，78，82-88，102-107，112-117，121，128

15、-130，170-179，184-190，209-214，226-231，240-246，263-271，276-285，292-299，308-311，316-321，324-331，338-340，368-377，382-386，390-391，396-401，408-412，416，421-429，447-460，480-484，491-515和541-546區(qū)域形成β折疊的可能大；F蛋白的柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域位于N端第52，66-67，

16、98-100，216-218，222，236-239，303-306，334-336，343，348-351，357-359，380-381，402-405，439，462-463，470-472，523-524和537-539區(qū)段。綜合分析推測(cè)Nipah病毒F蛋白的B細(xì)胞表位最有可能位于N端第95-105和519-539區(qū)段，另外F蛋白N端第42-54，216-225，301-307，356-365和470-482區(qū)段也可能存在B細(xì)胞

17、表位。 結(jié)論： 1.本課題組前期開發(fā)的西尼羅病毒一步法Real-time RT-PCR方法敏感性高、特異性好，能準(zhǔn)確定量，適用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和病毒性疾病檢測(cè)。 2.初步流行病學(xué)研究提示我國西部重慶地區(qū)部分人群和豬群中暫未發(fā)現(xiàn)WNV感染。 3.初步流行病學(xué)研究提示我國西部新疆地區(qū)部分驢群中暫未發(fā)現(xiàn)WNV感染。 4.初步流行病學(xué)研究提示我國西部寧夏地區(qū)部分羊群和牛群中暫未發(fā)現(xiàn)WNV感染。