BDV的核酸檢測方法和西部地區(qū)BDV感染的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、當(dāng)中國的SARS、馬來西亞的尼巴病毒（NiV）、美國的西尼羅河病毒（WNV）以及全球的禽流感病毒所引起的一場場席卷全球的各種病毒性疾病爆發(fā)流行時，人們在極度恐慌的同時也進行了反思，為什么不能預(yù)測這些傳染病的爆發(fā)流行？為什么對疾病的流行缺乏有效的監(jiān)控措施和疫情預(yù)報？現(xiàn)有的防治策略和措施為什么收效甚微？這些都促使我們對新發(fā)病毒性疾病的防治工作和公共衛(wèi)生體系的建設(shè)有了新的認(rèn)識。及早的對可能成為的新發(fā)感染性疾病致病原的病毒給予關(guān)注，盡早的研究發(fā)

2、現(xiàn)這些病毒的起源、傳播、與臨床表現(xiàn)和預(yù)后相關(guān)的宿主因素、診斷方法和治療措施，為防止這些病毒的大流行打下基礎(chǔ)，已成為目前迫切需要解決的重大公共衛(wèi)生問題。 目的: 本研究旨在關(guān)注中樞神經(jīng)新發(fā)感染性病毒Borna病病毒（Borna disease virus，BDV），擬對BDV一步法實時RT-PCR檢測方法進行一些有益的探索，并和前期開發(fā)建立的BDV熒光定量套式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-nRT-PCR）檢測方法進行比較，優(yōu)

3、選出快速、準(zhǔn)確、敏感、特異的檢測BDV的方法，為大規(guī)模流行病學(xué)監(jiān)測提供一種簡便、可靠的檢測手段。同時，應(yīng)用所建立的檢測方法，對采集自中國新疆伊犁地區(qū)的和重慶三峽庫區(qū)的馬、豬外周血、腦組織樣本分別進行BDV檢測，以獲得我國西部部分地區(qū)的BDV的病毒流行病學(xué)資料，為BDV感染性疾病的可能爆發(fā)流行提供預(yù)警，同時也為某些神經(jīng)精神疾病的病因?qū)W診斷及其防治提供新的思路和依據(jù)。 方法: 1.根據(jù)GenBank提供的基因序列，針對BDV

4、基因的保守區(qū)域（BDV p24基因），設(shè)計并合成特異性引物和熒光標(biāo)記TaqMan探針。從含有目的基因的質(zhì)粒出發(fā)，利用PCR方法擴增獲得目的基因，克隆至pBS-T載體進行體外轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA純化并使用RiboGreen方法進行定量后作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，初步建立BDV的一步法實時RT-PCR方法，對其敏感性和特異性進行探討；同時與前期本課題組建立檢測BDV的FQ-nRT-PCR方法進行比較分析。 2.自2007年6月起，采集自中國西

5、部部分地區(qū)動物標(biāo)本共480份（新疆伊犁地區(qū)天然牧場上放養(yǎng)馬的外周血和腦組織標(biāo)本120份、重慶及三峽庫區(qū)鄉(xiāng)村飼養(yǎng)的豬外周血標(biāo)本360份），使用密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。用優(yōu)選的BDV檢測方法，對樣本進行BDV檢測。對陽性樣本進行PCR產(chǎn)物序列鑒定、序列分析等研究，在可能的情況下進行病毒分離培養(yǎng)，并提交流行病學(xué)調(diào)查報告。 結(jié)果: 1.對所設(shè)計的BDV引物和探針序列，登錄美國國立衛(wèi)生

6、研究院網(wǎng)站（http：//www.Ncbi.Nlm.Nih.Gov/BLAST/）進行Blast檢索，所設(shè)計的引物和探針可以與已公布的BDV病毒株序列匹配。 2.本研究建立BDV一步法實時RT-PCR方法的最低檢出限即敏感性為1.7×102copies/μl，標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍分別為1.7×102～1.7×106copies/μl，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9998，不與其他病毒發(fā)生非特異反應(yīng)。該方法具有較好的靈敏性和特異性，在BD

7、V流行病學(xué)研究中可以選擇使用。 3.對采集自中國新疆伊犁地區(qū)的和重慶及三峽庫區(qū)的馬、豬外周血、腦組織樣本分別進行BDV檢測，新疆伊犁地區(qū)有3例馬外周血和腦組織中同時檢測到博爾納病毒，陽性率為2.5％（3/120）。擴增產(chǎn)物序列與其他國外馬源BDV分離株同源性大于93％，與標(biāo)準(zhǔn)株He/80同源性達(dá)到98％以上。重慶及三峽庫區(qū)的BDV p24基因片段陽性率在360只豬的PBMC BDV-p24基因的陽性檢出率為4.44％。序列分析結(jié)

8、果表明，重慶及三峽庫區(qū)豬感染的BDV核苷酸序列與馬He/80同源性為100％，并且編碼的氨基酸序列也相同。 結(jié)論: 1.本研究構(gòu)建了BDV p24基因檢測用的RNA及DNA標(biāo)準(zhǔn)品，并初步建立了BDV的一步法實時RT-PCR檢測方法，與本課題組前期建立的FQ-nRT-PCR檢測方法相比，F(xiàn)Q-nRT-PCR方法，具有更好的靈敏性和特異性，并且有穩(wěn)定性和重復(fù)性好等特點，適于流行病學(xué)研究和BDV相關(guān)性疾病的診斷。 2.