補腎中藥血清對成骨細胞中BMP2、7與Smad1-5信號轉(zhuǎn)導蛋白活性的影響.pdf

1、目的：
　　 通過研究補腎中藥血清對離體SD大鼠成骨細胞中BMP2、BMP7、Smad1/5在細胞中活性的變化，探討骨質(zhì)疏松癥病機的分子生物學機制；研究補腎益髓壯骨中藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機理，從而為臨床防治骨質(zhì)疏松癥提供科學的實驗依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 采用多次膠原酶消化法獲取新生SD大鼠顱蓋骨中的成骨細胞進行體外培養(yǎng)，并應(yīng)用Gomori改良鈣鈷法對其進行堿性磷酸酶表達的鑒定。隨機將實驗用大鼠分為正常

2、組、骨疏康顆粒對照組（骨疏康組）、補腎中藥組（補腎組）、補中益氣顆粒對照組（補脾組）；對實驗大鼠給藥干預(yù)8天后，通過血清藥理學的方法使用各組大鼠血清培養(yǎng)成骨細胞48小時，另設(shè)加入UPP通路的蛋白酶體抑制劑MG132作為對照組；應(yīng)用MTT法檢測離體成骨細胞的增殖率，并應(yīng)用免疫組化SABC法檢測成骨細胞中BMP2、BMP7、Smad1/5活性的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1補腎中藥血清作用于體外培養(yǎng)的成骨細胞48小時后可以明

3、顯促進成骨細胞的增殖（P<0.01）。
　　 2應(yīng)用UPP通路蛋白酶體抑制劑MG132可以明顯抑制成骨細胞的增殖（P<0.01）。
　　 3成骨細胞堿性磷酸酶染色結(jié)果：成骨細胞經(jīng)Gomori改良鈣鈷法染色和蘇木精復染后，可見棕黑色細微顆粒，多數(shù)分布于細胞膜上以及周圍，胞漿中也可見到少量顆粒。陰性對照組細胞內(nèi)無棕黑色顆粒，細胞核內(nèi)可見嗜蘇木精之藍色顆粒。
　　 4成骨細胞BMP2免疫組化結(jié)果：與正常組比較，骨疏康組

4、和補腎組表達水平明顯上升（P<0.01）；補脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補腎組和MG132+補脾組表達水平明顯降低（P<0.01）。與補腎組比較，各組的表達水平均明顯降低（P<0.01）。
　　 5成骨細胞BMP7免疫組化結(jié)果：與正常組相比，補腎組表達水平明顯上升（P<0.01）；骨疏康組、補脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補腎組和MG132+補脾組表達水平明顯降低（P

5、<0.01）。與補腎組比較，各組表達水平均明顯降低（P<0.01）。加入MG132的各含藥血清組中，MG132+正常組表達水平最高，MG132+補腎組與MG132+正常組比較其陽性表達水平降低（P<0.01）。
　　 6成骨細胞Smad1/5免疫組化結(jié)果：與正常組相比，補腎組、骨疏康組、補脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補腎組和MG132+補脾組表達水平明顯降低（P<0.01）。與補腎組比較，骨疏康組

6、、補脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補腎組和MG132+補脾組表達水平明顯降低（P<0.01）。加入MG132的各含藥血清組中，MG132+正常組表達水平最高，MG132+補腎組與MG132+正常組比較陽性表達水平降低（P<0.01）；MG132+補腎組與MG132+骨疏康組、MG132+補脾組比較陽性表達水平上升（P<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1采用多次膠原酶消化法獲取大鼠成骨細胞進

7、行體外培養(yǎng)的方法是可靠、簡便、易行的，可以提供大量高純度的成骨細胞用于科學研究使用。
　　 2體外培養(yǎng)的新生大鼠顱蓋骨中存在BMP2、BMP7和Smad1/5的活性表達，表明正常大鼠成骨細胞中存在BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導通路。
　　 3補腎中藥血清可以明顯促進成骨細胞的增殖，明顯升高成骨細胞中BMP2、BMP7和Smad1/5的表達水平，提示補腎益髓壯骨中藥具有防治骨質(zhì)疏松癥的作用。
　　 4應(yīng)用UPP通路的蛋白