機械力學刺激對成骨細胞功能及信號轉(zhuǎn)導的影響.pdf

1、第一部分機械力學刺激對MG-63成骨樣細胞增殖分化的影響 目的：觀察機械力學刺激對MG-63成骨樣細胞增殖分化的影響。 方法：人成骨肉瘤MG-63細胞株購自美國培養(yǎng)物保存中心(ATCC號：CRL1427)。采用根據(jù)四點彎曲原理設計的細胞加力裝置，分別采用不同大小應變值的張應力(0、1000、2000、4000、6000μstrain)以及不同的刺激時間(0、1、3、6、12h)對MG-63樣成骨細胞進行力學刺激。用α-磷

2、酸奈酚法測定堿性磷酸酶(ALP)活性；半定量RT-PCR檢測Ⅰ型膠原(COL Ⅰ)、骨鈣素(OC)、骨橋素(OPN)的mRNA的表達；免疫印跡法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、COLⅠ蛋白的表達；用10mmβ-甘油磷酸鈉和50μg/ml抗壞血酸誘導MG-63成骨樣細胞分化成熟，在這個過程中進行力學刺激，分別在第18天和第24天，用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成。 結(jié)果：當應變值為2000μstrain時，力學刺激對MG-63成骨樣細

3、胞PCNA蛋白表達以及ALP活性的促進作用最強。當應變值為2000μstrain時，力學刺激呈時間依賴性明顯上調(diào)了MG-63成骨樣細胞PCNA蛋白、ALP活性、COL Ⅰ蛋白及mRNA、OC mRNA、OPN mRNA的表達；茜素紅染色結(jié)果顯示，力學刺激組較對照組更加容易形成礦化結(jié)節(jié)。 結(jié)論：適宜的機械力學刺激促進了MG-63成骨樣細胞增殖分化指標如PCNA、ALP、COL Ⅰ、OC及OPN等的表達，說明機械力學刺激在成骨細胞增

4、殖分化過程中發(fā)揮重要作用。 第二部分機械應力對MG-63成骨樣細胞結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達影響及機制研究 目的：觀察機械力學刺激對MG-63成骨樣細胞C17GF表達的影響，對絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路(包括ERK、JNK及p38)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT的影響以及MAPK、磷脂酰肌醇3激酶(P13K)信號通路在這一過程中的作用。

5、 方法：用免疫印跡法及免疫細胞化學染色檢測CTGF蛋白的表達。MAPK、AKT信號通路的活化也采用免疫印跡法檢測。CTGFmRNA表達采用半定量RT-PCR檢測。 結(jié)果：機械力學刺激促進了MG-63成骨樣細胞CTGF的表達，且力學刺激能夠激活ERK及JNK信號通路，但對不能使p38信號通路激活。JNK信號通路阻斷劑能夠阻斷應力刺激對CTGF上調(diào)作用。應力刺激不能激活AKT 信號通路，但P13K信號通路阻斷劑阻斷了力學刺激

6、對JNK的活化，并且也阻斷了力學刺激對CTGF表達的促進作用。 結(jié)論：機械力學刺激通過JNK依賴的信號途徑促進了MG-63成骨樣細胞CTGF的表達，并且P13K-JNK途徑在這一過程中起重要作用。 第三部分機械應力刺激對OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的影響 目的：觀察力學刺激對MG-63成骨樣細胞護骨素(osteoprotegrin，OPG)及細胞核因子-кB受體活化因子配體(receptor activato

7、r ofnuclear factor kappa B ligand，RANKL)的表達，以及對小鼠前破骨細胞RAW264.7細胞核因子-кB受體活化因子(receptor activator ofnuclear factor kappa B，RANK)表達的影響；觀察MAPK信號通路在力學刺激引起的OPG表達中的作用；觀察力學刺激對RANKL誘導的小鼠前破骨細胞RAW264.7分化的影響。 方法：用免疫印跡法檢測MG-63成骨樣

8、細胞OPG、RANKL及小鼠前破骨細胞RAW264.7 RANK蛋白的表達。用半定量RT-PCR檢測MG-63成骨樣細胞OPG mRNA的表達。用50 ng/ml的RANKL誘導RAW264.7細胞6天后，用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察TRAP陽性多核細胞(即破骨細胞)。 結(jié)果：機械力學刺激明顯促進了MG-63成骨樣細胞OPG蛋白及mRNA的表達，但對RANKL蛋白的表達沒有明顯影響。力學刺激能夠激活ERK及JNK信號

9、通路，但對不能使p38信號通路激活。ERK信號通路阻斷劑能夠阻斷力學刺激引起的OPG蛋白的表達。力學刺激對小鼠前破骨細胞RAW64.7 RANK蛋白的表達沒有明顯作用，但力學刺激能夠顯著抑制RANKL誘導的前破骨細胞RAW264.7的分化成熟。 結(jié)論：機械力學刺激促進了MG-63成骨樣細胞OPG的表達，并且能夠抑制前破骨細胞RAW264.7向成熟破骨細胞的分化，這可能是力學刺激能夠促進骨形成、抑制骨吸收的機制之一。 第四

10、部分Integrinβ1/FAK在力學信號轉(zhuǎn)導中的作用 目的：觀察整合素-β<,1>(Integrin-β1)在MG-63成骨樣細胞增殖分化過程中表達的變化。觀察機械力學刺激對MG-63成骨樣細胞Integrin-β<,1>表達，以及對粘著斑激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)信號途徑的影響。觀察力學刺激對Integrin-β<,1>及FAK之間相互作用的影響，以及Integrin-β<,1>是否介導了力學

11、刺激對FAK及ERK的活化過程。 方法：Imegrin-β<,1>蛋白表達及FAK信號途徑活化程度采用免疫印跡法檢測。Integrin-β<,1> mRNA的表達采用實時定量PCR檢測。用細胞免疫熒光染色顯示FAK。用免疫共沉淀法檢測Integrin-β<,1>與FAK的相互作用。 結(jié)果：在MG-63成骨樣細胞增殖分化過程中，Integrin-β<,1>的表達呈現(xiàn)雙峰式表達，即在增殖末期及礦化期表達明顯增高。機械力學刺激