RAGE參與CRP誘導(dǎo)的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞釋放.pdf

1、研究背景:
　　 川崎病是一種在5歲以下兒童中常見的急性發(fā)熱性疾病，以全身性中小動脈炎癥損傷為主要特征，尤其以冠狀動脈損傷最為嚴(yán)重和常見。川崎病的病因不明，以全身性中小動脈炎癥損傷為主要病理特征，尤其以冠狀動脈損傷最為嚴(yán)重和常見。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation End ProductsRAGE)是免疫蛋白超家族中的一員。S100A12是一種促炎因子，可以與RAGE結(jié)合，S1

2、00A12-RAGE軸在各種疾病中的促炎作用被許多研究所證實。血管內(nèi)皮細(xì)胞是一層連續(xù)覆蓋于整個血管腔表面的扁平細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂不僅僅是心血管損傷的早期表現(xiàn)，而且在整個內(nèi)皮損傷過程中起著重要作用。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物，血液中循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞增加往往意味著更高的心血管損傷風(fēng)險。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)川崎病患兒循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞增加，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞上S100A12及其受體RAGE表達(dá)增加，而且這種增加在有冠狀動脈損傷

3、的患兒中更為明顯，但S100A12與RAGE在川崎病心血管病變中的的作用與機(jī)制有待于進(jìn)一步明確。CRP是一種急性期蛋白，在多種炎癥疾病中會反應(yīng)性增高，許多研究證實CRP不僅是一種炎癥因子，而且直接參與了內(nèi)皮損傷的過程，川崎病急性期有普遍的CRP水平升高，而且有較高水平CRP的患兒罹患冠狀動脈損傷的風(fēng)險更高。有研究證實CRP與RAGE有密切聯(lián)系，CRP能誘導(dǎo)內(nèi)皮RAGE的表達(dá)升高，而且RAGE可能參與了CRP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，但CRP與RA

4、GE之間的關(guān)系仍然有待進(jìn)一步研究證實。
　　 目的:
　　 用不同濃度的重組人S100A12蛋白或人血漿來源的CRP作用于培養(yǎng)的人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察不同濃度組循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的變化，比較S100A12或CRP作用對循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響。建立小干擾RNA（siRNA）干擾RAGE表達(dá)，觀察RAGE沉默是否能抑制CRP誘導(dǎo)的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞變化。
　　 方法:
　　 人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞購自ATCC（美國模式

5、菌種收集中心），4-6代細(xì)胞用于所有實驗。
　　 第一部分:CRP或S100A12對循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響
　　 分別用不同濃度的CRP（0，12.5，25，50μg/ml）或者S100A12(0，4，10，25μg/ml)與人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24h，收集細(xì)胞，測定不同濃度CRP或S100A12作用內(nèi)皮細(xì)胞24h后，各濃度組循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量測定采用流式細(xì)胞術(shù)，用anti-CD146-FITC，

6、anti-CD105-APE，anti-CD45-Percp-cy5.5，anti-CD34-PE染色細(xì)胞，篩選CD146(+)，CD105(+)，CD45(-)，CD34(+)為循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，每組實驗重復(fù)4次。
　　 第二部分:RAGE小干擾RNA（siRNA）的建立
　　 設(shè)計合成3條siRNA用于沉默內(nèi)皮細(xì)胞RAGE表達(dá)，另外設(shè)計了FITC標(biāo)記的siRNA-GADPH作為陽性對照，用于檢測siRNA轉(zhuǎn)染效率，以及無

7、效siRNA作為對照組，用于檢測siRNA沉默RAGE效率。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine2000Transfection Reagent，待細(xì)胞長至40％左右開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
　　 (1) siRNA轉(zhuǎn)染人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞效率檢測:
　　 用FITC標(biāo)記的內(nèi)參siRNA-GADPH轉(zhuǎn)染細(xì)胞6h后，除去培養(yǎng)基，用PBS液洗細(xì)胞3次后，Hoechst室溫避光染色30min，再洗滌細(xì)胞3次，熒光顯微鏡觀察紅色熒光和藍(lán)色熒

8、光，計算轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞百分比。
　　 (2) siRNA沉默人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞RAGE表達(dá)檢測
　　 分別用siRNA1、siRNA2、siRNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用無效siRNA作為對照組，48h后相對定量Real-time PCR檢測細(xì)胞mRNA水平上RAGE表達(dá)，每組實驗重復(fù)3次。
　　 第三部分:RAGE干擾RNA抑制了CRP誘導(dǎo)的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞增加
　　 25μg/ml濃度的CRP分別作用于人冠狀動脈內(nèi)

9、皮細(xì)胞和RAGE沉默（siRNA作用24h）后的人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞，并設(shè)立空白及對照組，比較不同組循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的變化，每組實驗重復(fù)4次。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:CRP誘導(dǎo)了循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的釋放，但S100A12未能誘導(dǎo)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞釋放
　　 1.不同濃度S100A12與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24h對循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞釋放的影響
　　 與對照組相比，S100A12作用后，各濃度組循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量差異較小。各S1

10、00A12（0，4，10，25μg/ml）濃度組循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞百分比值分別為:11.97±4.16％，11.08±6.02％，10.91±3.16％，9.66±0.64％，各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.不同濃度CRP與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24h對循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞釋放的影響
　　 與對照組相比，CRP作用后，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量均增加，存在一定濃度依賴關(guān)系，當(dāng)CRP濃度＞25μg/ml時，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量顯著增加。各CRP(0，12.

11、5，25，50μg/ml)濃度組循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞百分比值分別為:6.82±1.64％，9.66±3.39％，12.22±3.33％，12.47±4.25％。與對照組相比25μg/ml及50μg/ml組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 第二部分:RAGE小干擾RNA(siRNA)的建立和檢測
　　 1.約＞80％細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染siRNA
　　 2.與對照組相比，siRNA1、siRNA2、siRNA3均能在mRNA水平上沉默RA

12、GE表達(dá)，siRNA2沉默效率最高，波動最小，各siRNA干擾組(siRNA1、siRNA2、siRNA3)與對照組比較，mRNA水平上RAGE表達(dá)百分比分別為:0.53±0.16，0.34±0.08,0.45±0.20。
　　 第三部分:siRNA抑制了CRP誘導(dǎo)的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞釋放
　　 siRNA沉默RAGE抑制了CRP誘導(dǎo)的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞增加，各組循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞百分比值分別為:空白組10.39±2.93％，對照組:9.