蛋氨酸對(duì)順鉑引起的內(nèi)耳毒性保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:順鉑是在臨床當(dāng)中廣泛應(yīng)用的化療藥物，主要用于卵巢癌、睪丸癌、肺癌、頭頸部腫瘤和膀胱癌。雖然其抗腫瘤的療效可以肯定，但是它的副作用在治療的過程中和治療后發(fā)生，這些副作用包括消化道反應(yīng)、腎毒性、神經(jīng)毒性和耳毒性。聽力損傷的主要特點(diǎn)是雙側(cè)進(jìn)行性、不可逆性的，往往累及的是高頻聽力，嚴(yán)重時(shí)可以累及中低頻聽力。目前的研究大多集中在順鉑的聽力損傷方面，但順鉑導(dǎo)致的前庭功能紊亂同樣不能忽視，前庭功能的紊亂可直接引起患者眩暈并喪失行動(dòng)能力，這樣就嚴(yán)

2、重影響了許多腫瘤病人康復(fù)后的生存質(zhì)量。
　　 順鉑導(dǎo)致內(nèi)耳毒性的機(jī)制目前尚未完全闡明，其對(duì)耳蝸形態(tài)的影響主要表現(xiàn)在Corti器的外毛細(xì)胞、血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)三方面，而前庭組織的形態(tài)學(xué)暫時(shí)還沒有充分的報(bào)道可供參考?；钚匝醮?ROS)在順鉑內(nèi)耳毒性中所起的作用得到廣泛認(rèn)可。ROS積聚后產(chǎn)生的亞硝酸鹽可以破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能;ROS還作用于構(gòu)成細(xì)胞膜的多不飽和脂肪酸，使之變性生成具有更強(qiáng)毒性的4-羥基壬烯醛(4-HNE)，4-HNE

3、與Ca2+內(nèi)流密切相關(guān)，而Ca2+內(nèi)流可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，耳蝸中存在大量縫隙連接蛋白，即Connexin26(Cx26)和Connexin30(Cx30)，對(duì)于正常的聽力是必不可少的，Cx26和Cx30因在遺傳性耳聾中的作用而被廣泛關(guān)注，但兩種蛋白是否參與了順鉑導(dǎo)致的耳毒性和前庭毒性的發(fā)病機(jī)制，國(guó)內(nèi)外目前還沒有相關(guān)研究。在預(yù)防耳毒性上，蛋氨酸可以減少順鉑導(dǎo)致的聽功能損傷和耳蝸毛細(xì)胞的丟失，是一種很好的內(nèi)耳保護(hù)藥物。
　

4、　 我們將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來研究蛋氨酸在功能學(xué)、形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激水平和凋亡水平上對(duì)順鉑引起的內(nèi)耳毒性是否均具有保護(hù)作用，以及連接蛋白Cx26和Cx30是否參與了順鉑導(dǎo)致的耳毒性和前庭毒性，蛋氨酸能否對(duì)Cx26和Cx30在順鉑中的變化產(chǎn)生影響。
　　 方法:30只雄性昆明小鼠按照隨機(jī)原則分為①對(duì)照組(n=10)②順鉑組(n=10)③蛋氨酸+順鉑組(n=10)。①對(duì)照組:腹腔注射生理鹽水2ml，1次/天，連續(xù)3天;②順鉑組:腹腔注射順

5、鉑溶液15mg/kg體重，1次/天，連續(xù)3天;③蛋氨酸+順鉑組:首先腹腔注射蛋氨酸溶液400mg/kg體重，一個(gè)小時(shí)后，腹腔注射順鉑溶液15mg/kg體重，1次/天，連續(xù)3天。三組昆明小鼠在造模前和造模后，都接受聽覺腦干反應(yīng)(ABR)和前庭誘發(fā)肌電位(VEMP)的測(cè)試來評(píng)估聽力功能和前庭功能，依據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求來收集基底膜組織和前庭組織的標(biāo)本。通過基底膜及前庭組織鋪片HE染色和myosin-Ⅵ染色來觀察各組毛細(xì)胞的存活情況;通過脂質(zhì)過氧

6、化產(chǎn)物4-HNE免疫組織化學(xué)和TUNEL凋亡檢測(cè)來研究各組內(nèi)耳中的氧化應(yīng)激水平和凋亡情況;通過Cx26和Cx30免疫熒光組織化學(xué)染色及Cx26和Cx30westernblot檢測(cè)來觀察兩種蛋白在各組中的表達(dá)，從而研究蛋氨酸是否在上述方面對(duì)順鉑引起的耳毒性和前庭毒性具有保護(hù)作用。利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，以P＜0.05為存在顯著性差異的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.一般觀

7、察結(jié)果:對(duì)照組小鼠正常生長(zhǎng)，好動(dòng)，耳廓反應(yīng)靈敏;順鉑組小鼠毛發(fā)無光澤，消瘦，不好動(dòng)，耳廓反應(yīng)不靈敏;蛋氨酸+順鉑組小鼠正常生長(zhǎng)，毛發(fā)有光澤，略消瘦，好動(dòng)，耳廓反應(yīng)較靈敏。
　　 2.聽覺腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試結(jié)果:實(shí)驗(yàn)前各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ABR閾值、潛伏期及波間期沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;試驗(yàn)后對(duì)照組小鼠閾值為（3.25±3.35）dBSPL，順鉑組小鼠閾值為（63.10±19.87）dBSPL，蛋氨酸+順鉑組小鼠閾值為（41.67±13.17

8、）dBSPL，三組之間兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 3.前庭誘發(fā)肌電位(VEMP)測(cè)試結(jié)果:造模前三組小鼠VEMP檢測(cè)均引出正常的波形，且各組間Ⅰ波、Ⅱ波潛伏期沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。造模后，正常組小鼠可以引出正常波形，Ⅰ波、Ⅱ波潛伏期分別為（0.57±0.12）ms和（0.89±0.13）ms;順鉑組小鼠均未引出正常的波形;蛋氨酸+順鉑組小鼠可以引出波形，但Ⅰ波、Ⅱ波潛伏期分別是（1.60±0.54

9、）ms和（1.98±0.53）ms，與對(duì)照組相比Ⅰ波、Ⅱ波潛伏期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 4.基底膜及前庭組織鋪片HE染色和myosin-Ⅵ染色結(jié)果:對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)現(xiàn)變性、缺損;順鉑組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與對(duì)照組相比，毛細(xì)胞出現(xiàn)較為明顯的缺失，以外毛細(xì)胞更為明顯;蛋氨酸+順鉑組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與對(duì)照組相比，毛細(xì)胞出現(xiàn)散在的缺失，主要出現(xiàn)在外毛細(xì)胞，剩余毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整。
　　 5.4-

10、HNE免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:對(duì)照組耳蝸組織切片中耳蝸基底膜、血管紋、螺旋側(cè)韌帶和球囊中沒有表達(dá)4-HNE;順鉑組耳蝸基底膜、血管紋、螺旋側(cè)韌帶和球囊中都非常強(qiáng)烈地表達(dá)了4-HNE;蛋氨酸+順鉑組耳蝸基底膜、血管紋、螺旋側(cè)韌帶中出現(xiàn)了4-HNE的表達(dá)，但明顯弱于順鉑組，球囊中幾乎沒有4-HNE的表達(dá)。
　　 6.TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果:對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸組織切片TUNEL染色沒有發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，球囊中同樣沒有發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞;順鉑

11、組在耳蝸組織基底膜、血管紋和螺旋側(cè)韌帶上出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，球囊中散在出現(xiàn)了凋亡細(xì)胞;蛋氨酸+鉑組在耳蝸組織基底膜、血管紋和螺旋側(cè)韌帶上局部出現(xiàn)散在的凋亡細(xì)胞，但凋亡細(xì)胞的數(shù)量要明顯少于順鉑組，球囊則沒有發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞。
　　 7.Cx26和Cx30免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果:對(duì)照組耳蝸組織切片中，耳蝸組織基底膜、血管紋和螺旋側(cè)韌帶上存在大量的Cx26和Cx30蛋白，球囊中同樣存在大量的Cx26和Cx30蛋白;順鉑組耳蝸組織基

12、底膜、血管紋、螺旋側(cè)韌帶以及球囊上Cx26和Cx30蛋白出現(xiàn)了明顯的減少;蛋氨酸+順鉑組耳蝸組織和球囊中的Cx26和Cx30蛋白要多于順鉑組，但較對(duì)照組還是出現(xiàn)了一定程度的下降。
　　 8.Cx26和Cx30westernblot檢測(cè)結(jié)果:順鉑組中Cx26和Cx30的表達(dá)要明顯弱于對(duì)照組和蛋氨酸+順鉑組，即兩種蛋白在順鉑組中出現(xiàn)了明顯的下降，而對(duì)照組和蛋氨酸+順鉑組相比，Cx26和Cx30的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)